褪黑素腹腔注射对脑出血大鼠继发性脑损伤的抑制作用及其机制

蒋义碧，陈鑫，舒艺璇，郑晓梅

西南医科大学附属医院神经内科，四川 泸州 646099

脑出血（ICH）是一种发病率、病死率、致残率均较高的脑血管疾病，除原发性脑损伤之外，ICH引起的继发性脑损伤（SBI）是影响患者预后的主要原因［1］。研究显示，ICH后SBI的发生与炎症反应密切相关，炎症小体激活可释放大量炎症因子，诱导炎症级联反应，从而加重脑组织损伤及神经细胞死亡［2］。细胞焦亡是新近发现的一种高度促炎性程序性细胞死亡方式，主要由核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）/半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1（Caspase-1）/消皮素D（GSDMD）经典焦亡途径介导，可在细胞膜上形成孔隙，导致细胞肿胀破裂，细胞内炎症物质释放，引起周围组织强烈的炎症反应［3］。研究发现，ICH发生后小胶质细胞、神经元均可出现焦亡，而抑制细胞焦亡能够降低ICH患者的炎症反应，改善其神经功能［4］。因此，探究能够减轻ICH患者炎症反应、减少细胞焦亡的干预措施对于减轻ICH后的SBI具有重要意义。褪黑素是一种主要由松果体合成和分泌的激素，具有抗炎、抗氧化、调节昼夜节律等多种作用［5］。研究显示，NLRP3炎症小体是褪黑素发挥抗炎作用的关键靶点，褪黑素可通过抑制NLRP3炎症小体，减轻糖尿病小鼠神经元焦亡和自噬，从而发挥神经保护作用［6-7］。但目前褪黑素对ICH后SBI的影响及其相关机制研究较少，为此我们于2023年3月—10月进行了如下研究。

1 材料与方法

1.1 材料 实验动物：SPF级健康雄性大鼠72只，8～10周龄，体质量250～300 g，实验动物生产许可证号SCXK（川）2023-0017，实验动物使用许可证号SYXK（川）2023-0065；大鼠饲养环境通风清洁，温度（22 ± 1）℃，湿度50% ± 20%，每12 h昼夜周期循环，可自由获取水和食物。主要试剂：褪黑素、褪黑素受体抑制剂Luzindole均购自武汉阿拉丁生物有限公司，苏木素染液、伊红染液、ECL化学发光检测试剂盒、BCA蛋白质浓度测定试剂盒、NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白一抗、二抗稀释液均购自美国Aspen公司，白细胞介素18（IL-18）、白细胞介素1β（IL-1β）试剂盒、TUNEL试剂盒均购自武汉科鹿生物科技有限公司。主要仪器：荧光定量PCR仪购自美国Life Technologies公司，正置荧光拍照显微镜购自日本Nikon公司。

1.2 ICH大鼠模型建立及褪黑素干预 将72只大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组、褪黑素组、抑制剂组，每组18只。模型组、褪黑素组、抑制剂组均采用基底节注射胶原酶的方法建立ICH模型：大鼠经3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于脑立体定位仪上，于距中线3.0 mm、前囟后1.0 mm处钻孔，使用5 μL注射器抽取Ⅶ型胶原酶0.6 U，进针深度5.8 mm、注射时长5 min，针头留于原位约10 min后缓慢拔出；骨蜡封闭钻孔，缝合切口，碘伏消毒［8］。假手术组仅钻孔后插入针头，不注射胶原酶。各组建模后行Longa评分，评分1～3分提示建模成功。模型建立成功后，褪黑素组腹腔注射褪黑素30 mg/kg，抑制剂组腹腔注射Luzindole 30 mg/kg，假手术组、模型组腹腔注射等量生理盐水，连续给药3 d。

1.3 神经功能损伤评估 ①改良神经功能缺损评分（mNSS）：各组分组处理后采用mNSS评估运动、感觉、平衡和反射功能，mNSS越高提示神经功能损伤程度越严重。②转角实验：各组分组处理后采用转角实验评估肢体协调能力。将两块挡板相交形成30°夹角，驱赶大鼠至夹角区域，观察大鼠进入夹角后向左或向右转身情况，每只测试10次。向左转身百分比 = 左转身次数/所有转身次数 × 100%，向左转身百分比越高表示损伤越小。③前肢放置实验：各组分组处理后采用前肢放置实验评估运动功能。研究人员轻轻抓住大鼠项背部皮肤，使其四肢脱离平面悬空，放松状态下以其胡须轻触桌面边缘，观察其左前肢成功放置桌面情况，每只测试10次。左前肢成功放置率 = 左前肢成功放置次数/所有放置次数 × 100%，左前肢成功放置率越高表示损伤越小。

1.4 脑组织含水量检测 采用干湿比重法。各组大鼠神经功能评估结束后抽取尾静脉血，静脉注射戊巴比妥钠150 ～ 200 mg/kg处死，立即分离病灶侧大脑半球，用电子分析天平称量获得脑组织湿重。将脑组织在（100 ± 5）℃恒温电干燥器中干燥48 h，称量获得脑组织干重。脑组织含水量 = （湿重 - 干重）/湿重 × 100%。

1.5 脑组织病理观察 采用HE染色。取各组病灶侧大脑组织，4%多聚甲醛保存并固定24 h，石蜡包埋、切片、烤片，石蜡切片脱蜡、水洗和脱水。进行HE染色，中性树胶封片，200倍显微镜下观察脑组织病理改变。

1.6 血清IL-18、IL-1β水平检测 采用ELISA法。取各组大鼠尾静脉血，4 ℃条件下3 000 r/min离心30 min，取上层血清，严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作。检测450 nm波长处的光密度（OD）值，通过标准曲线计算血清IL-18、IL-1β水平。

1.7 脑组织NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA检测 采用实时荧光定量PCR法。于冰上取各组病灶侧血肿周围脑组织约20 mg，加入TRIzol试剂提取总RNA，紫外分光光度计检测总RNA的浓度及纯度。使用EnTurbo™ SYBR Green PCR Super Mix试剂盒进行PCR反应，严格按照试剂盒说明书操作。以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA相对表达量。

1.8 脑组织NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白检测采用Western blotting法。取各组大鼠病灶侧血肿周围脑组织，加入组织蛋白提取剂，冰浴彻底匀浆并确保匀浆液完全裂解。4 ℃条件下，12 000 g/min离心10 min，收集上清液，采用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。制备蛋白质样品，取30 μg蛋白，使用10% SDS-PAGE凝胶进行电泳分离，转膜，5%脱脂奶粉封闭1 h。加入NLRP3、Caspase-1、GSDMD一抗（稀释比例均为1∶ 1 000），4 ℃摇床孵育过夜，加入稀释后的二抗，室温条件下孵育1 h。ECL发光显影，Image J软件检测条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.9 脑组织细胞焦亡情况观察 ①GSDMD阳性小胶质细胞数量：采用双重免疫荧光染色。取各组大鼠病灶侧血肿周围脑组织，石蜡包埋后进行切片，脱蜡至水，置于柠檬酸盐缓冲液中。微波炉加热进行抗原修复，加入3%牛血清白蛋白孵育2 h，加入IBA-1、GSDMD一抗（稀释比例均为1∶ 200）孵育过夜，次日PBS冲洗5 min × 3次。加入二抗，室温避光孵育40 min，PBS冲洗5 min × 3次。滴加DAPI染核，室温避光孵育20 min。抗荧光淬灭封片剂封片，正置荧光显微镜下观察IBA-1与GSDMD共表达情况并拍照。使用Image J软件记录并分析数字图像，对1 mm2内的GSDMD阳性小胶质细胞进行计数。②TUNEL阳性细胞率：采用TUNEL法。取各组大鼠病灶侧血肿周围脑组织石蜡切片，脱蜡至水；配制工作液，37 ℃水浴锅孵育20 min；配置破膜液，室温孵育10 min。取TUNEL试剂盒内的TdT酶、CF488-dUTP绿光反应液、EB平衡缓冲液，按1∶ 5∶ 50的比例进行混合，37 ℃避光孵育1.5 h；滴加DAPI染核，室温避光孵育30 min。抗荧光淬灭封片剂封片，显微镜下观察拍照，计数横断面中的TUNEL阳性细胞数。TUNEL阳性细胞率 = TUNEL阳性细胞数细胞总数×100%。

1.10 统计学方法 采用SPSS27.0统计软件。计量资料采用K-S法检验正态性，呈正态分布以±s表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用两独立样本LSD-t检验，重复测量数据采用重复测量的方差分析；非正态分布以M（P25，P75）表示，两组间比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能损伤相关指标及脑组织含水量比较 假手术组、褪黑素组、抑制剂组、模型组大鼠mNSS及脑组织含水量均依次升高，组间两两比较P均＜0.05。与假手术组比较，褪黑素组、抑制剂组、模型组向左转身百分比及左前肢成功放置率均降低（P均＜0.05）；与模型组和抑制剂组比较，褪黑素组向左转身百分比及左前肢成功放置率均升高（P均＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠mNSS、向左转身百分比、左前肢成功放置率及脑组织含水量比较（± s）

表1 各组大鼠mNSS、向左转身百分比、左前肢成功放置率及脑组织含水量比较（± s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与褪黑素组比较，△P＜0.05。

组别假手术组模型组褪黑素组抑制剂组脑组织含水量（%）77.32 ± 1.35 85.88 ± 1.45*79.67 ± 1.40*#82.58 ± 1.50*#△n 18 18 18 18 mNSS（分）1.83 ± 0.75 10.00 ± 1.41*6.17 ± 1.17*#8.00 ± 1.41*#△向左转身百分比（%）58.33 ± 7.53 28.33 ± 7.53*46.17 ± 8.67*#33.33 ± 10.33*△左前肢成功放置率（%）73.33 ± 10.33 31.67 ± 7.53*48.33 ± 7.53*#35.00 ± 10.49*△

2.2 各组大鼠脑组织病理情况比较 假手术组细胞结构形态完整，排列整齐，分布均一，染色均匀；模型组可见炎症细胞浸润，神经细胞肿胀，神经细胞核消失，细胞排列紊乱，细胞组织结构染色加深；与模型组比较，褪黑素组炎症细胞浸润减少，细胞肿胀减轻，细胞排列相对整齐，细胞固缩、溶解减少；与褪黑素组比较，抑制剂组细胞形态不规则，排列分布不均，炎症细胞浸润增加，固缩坏死细胞数量增加。见OSID码图1。

2.3 各组大鼠血清IL-18、IL-1β水平比较 假手术组、褪黑素组、抑制剂组、模型组大鼠血清IL-18、IL-1β水平均依次升高，组间两两比较P均＜0.05。见表2。

表2 各组大鼠血清IL-18、IL-1β水平比较（pg/mL，± s）

表2 各组大鼠血清IL-18、IL-1β水平比较（pg/mL，± s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与褪黑素组比较，△P＜0.05。

IL-1β组别n IL-18 34.30 ± 6.61 90.47 ± 9.37*59.43 ± 6.77*#79.05 ± 6.97*#△假手术组模型组褪黑素组抑制剂组18 18 18 18 65.45 ± 5.92 148.65 ± 8.97*103.62 ± 7.78*#129.68 ± 8.55*#△

2.4 各组大鼠脑组织NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA及蛋白表达比较 假手术组、褪黑素组、抑制剂组、模型组大鼠脑组织NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA及蛋白相对表达量均依次升高，组间两两比较P均＜0.05。见表3及OSID码图2。

表3 各组大鼠脑组织NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA及蛋白相对表达量比较（± s）

表3 各组大鼠脑组织NLRP3、Caspase-1、GSDMD mRNA及蛋白相对表达量比较（± s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与褪黑素组比较，△P＜0.05。

组别假手术组模型组褪黑素组抑制剂组n 蛋白0.11 ± 0.02 0.54 ± 0.04*0.21 ± 0.03*#0.37 ± 0.05*#△NLRP3 mRNA 1.03 ± 0.07 4.11 ± 0.25*2.09 ± 0.22*#3.06 ± 0.23*#△蛋白0.14 ± 0.03 0.49 ± 0.04*0.25 ± 0.04*#0.40 ± 0.02*#△18 18 18 18 Caspase-1 mRNA 1.05 ± 0.05 3.44 ± 0.15*2.25 ± 0.13*#2.90 ± 0.18*#△蛋白0.11 ± 0.03 0.69 ± 0.06*0.25 ± 0.06*#0.52 ± 0.05*#△GSDMD mRNA 1.07 ± 0.05 4.54 ± 0.16*2.36 ± 0.25*#3.78 ± 0.21*#△

2.5 各组大鼠脑组织GSDMD阳性小胶质细胞数量、TUNEL阳性细胞率比较 假手术组、褪黑素组、抑制剂组、模型组大鼠脑组织GSDMD阳性小胶质细胞数量、TUNEL阳性细胞率均依次升高，组间两两比较P均＜0.05。见表4及OSID码图3、4。

表4 各组大鼠脑组织GSDMD阳性小胶质细胞数量、TUNEL阳性细胞率比较（± s）

表4 各组大鼠脑组织GSDMD阳性小胶质细胞数量、TUNEL阳性细胞率比较（± s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与褪黑素组比较，△P＜0.05。

组别假手术组模型组褪黑素组抑制剂组n GSDMD阳性小胶质细胞数量（个）TUNEL阳性细胞率（%）18 18 18 18 41.33 ± 6.71 187.67 ± 9.59*131.17 ± 8.89*#165.33 ± 7.58*#△0.93 ± 0.24 11.65 ± 1.48*3.78 ± 1.06*#7.60 ± 1.66*#△

3 讨论

ICH后SBI的发生机制十分复杂，主要与神经炎症反应、脑水肿、血液成分沉积的毒性作用等有关，神经炎症反应是加重ICH后SBI病情的关键因素［9］。炎症小体是中枢神经系统炎症与细胞死亡相互作用的关键介质，NLRP3炎症小体是目前研究最为广泛的炎症小体，既可介导神经炎症反应，又可介导细胞焦亡［10］。细胞焦亡是一种兼具凋亡和坏死细胞特征的促炎性程序性细胞死亡方式，主要病理表现为细胞膜上出现气泡状突出物，形成10～15 nm的小孔隙，同时也可出现核固缩、DNA断裂，TUNEL染色阳性等；随后细胞膜内外离子梯度降低，水分子弥散内流及细胞内钾离子外流，导致细胞内渗透压增高，细胞肿胀、细胞膜破裂，细胞内容物释放到细胞外，从而引起炎症反应、加重组织损伤［11］。

细胞焦亡主要由NLRP3/Caspase-1/GSDMD经典焦亡途径及Caspase-4/5/11非经典焦亡途径介导。当机体受到各种病原体及损伤分子模式刺激时可激活NLRP3，其招募凋亡相关斑点样蛋白、Caspase-1前体（Pro-Caspase-1），并与之组装形成NLRP3炎症小体，进而使细胞质中的Pro-Caspase-1形成具有活性的Caspase-1；随后，活化的Caspase-1既可将IL-18、IL-1β前体转化为有活性的IL-18和IL-1β，并促进其成熟和分泌，又可切割GSDMD蛋白，将其N-端孔隙形成结构域释放［12］。GSDMD是细胞焦亡的效应蛋白，在细胞焦亡的各种途径中均发挥重要作用，GSDMD的N端片段通过溶解磷脂或心磷脂在细胞膜上形成广泛的气溶性小孔隙，释放IL-18、IL-1β等炎症因子，引起一系列炎症级联反应［13］。小胶质细胞在维持中枢神经系统稳态中具有重要作用，而ICH后异常激活的小胶质细胞是NLRP3的主要来源，NLRP3又可以促进炎症因子释放、诱导细胞焦亡，进而加剧炎症反应，形成恶性循环，加重脑组织损伤。研究发现，小胶质细胞焦亡是ICH后继发性脑损伤的治疗靶点［14］。本研究结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠mNSS、向左转身百分比、左前肢成功放置率、脑组织含水量均升高，提示ICH大鼠存在SBI。本研究模型组较假手术组TUNEL阳性细胞率升高，表明ICH后发生了细胞焦亡；双重免疫荧光结果显示，GSDMD与小胶质细胞定位重合，将ICH后发生焦亡的细胞定位在小胶质细胞；此外，与假手术组比较，模型组大鼠血清IL-1β、IL-18水平以及脑组织中NLRP3、Caspase-1、DSDMD蛋白及mRNA相对表达量均升高，提示ICH后小胶质细胞焦亡的机制可能与NLRP3/Caspase-1/GSDMD经典焦亡途径的激活有关。

褪黑素是一种广泛分布于动植物中的内源性吲哚胺，具有强抗氧化及抗炎作用，且具有亲水性及亲脂性，能够轻易跨越血脑屏障，发挥神经保护作用［15］。目前研究证实，褪黑素可通过调节NLRP3炎症小体相关信号通路，在多种疾病中发挥抗焦亡作用［16］。研究发现，褪黑素可通过调节NF-κB/NLRP3信号通路，减轻急性高眼压所致的视网膜神经元焦亡［17］。另外，褪黑素可通过调节TLR4/NF-κB信号通路，抑制NLRP3炎症小体激活，减少心肌细胞焦亡，发挥心脏保护作用［18］。在脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤模型中，褪黑素通过激活Nrf2/HO-1信号通路而抑制NLRP3/GSDMD通路，有效减轻肺泡损伤、中性粒细胞浸润和肺水肿，从而减轻细胞焦亡、提高小鼠存活率［19］。本研究结果显示，与模型组比较，褪黑素组大鼠神经功能损伤与脑水肿减轻，固缩坏死细胞及炎症细胞浸润减少，提示褪黑素可以改善ICH后的SBI，发挥神经保护作用；褪黑素组较模型组脑组织焦亡相关蛋白及mRNA表达均降低，血清IL-18、IL-1β等炎症因子水平及TUNEL阳性细胞率、GSDMD阳性小胶质细胞数量均降低，提示褪黑素可抑制ICH大鼠脑组织细胞经典焦亡通路，减少小胶质细胞焦亡。另外本研究结果显示，与模型组比较，褪黑素组ICH大鼠神经功能损伤与脑水肿减轻、固缩坏死细胞及炎症细胞浸润减少，故推测褪黑素可能通过抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD细胞焦亡通路，减少促炎因子释放及小胶质细胞焦亡，从而改善ICH后SBI，发挥神经保护作用。

Luzindole为褪黑素膜结合位点MT1/MT2受体抑制剂。为进一步证明褪黑素能否改善ICH后SBI，以及其机制是否与NLRP3/Caspase-1/GSDMD焦亡途径有关，本研究对ICH大鼠予以褪黑素受体抑制剂Luzindole干预处理。结果显示，与褪黑素组相比，抑制剂组大鼠神经功能损伤及脑水肿加重，血清炎症因子水平及脑组织焦亡相关蛋白、mRNA表达均升高，提示抑制褪黑素受体后可加重ICH大鼠后的SBI，增加炎症反应及细胞焦亡。此外，褪黑素受体还存在核结合位点，包括类视黄醇孤儿受体α（RORα）和类视黄醇Z受体家族的孤儿受体（RZR），其与细胞分化和炎症反应有关。因此在本研究中，与模型组比较，抑制剂组可表现出改善神经损伤及减轻细胞焦亡的作用，考虑与褪黑素核结合相关受体发挥作用有关。

综上所述，褪黑素腹腔注射可减轻ICH大鼠的SBI情况，其机制可能与抑制NLRP3/Caspase-1/GSDMD信号通路而减少小胶质细胞焦亡及减轻神经细胞炎症反应有关。但未来仍需对该通路上游信号的具体调控机制进行探索，另外如何抑制焦亡效应蛋白GSDMD表达而减轻细胞焦亡，也是研究方向之一。