靶向人CD70的嵌合抗原受体巨噬细胞制备及其对肾癌的杀伤作用的研究*

张雅婷,杜玉菲,汪乐,肖漪,周一鸣

510120 广州,中山大学孙逸仙纪念医院 基础与转化医学研究中心

肾癌每年影响全球近四十万人,导致超过十万人死亡,在发达国家的发病率普遍较高[1-2]。根据2022年第五版WHO分类对肾癌进行分类,肾癌可大致分为几种亚型:透明细胞肾细胞癌、乳头状肾细胞癌、嫌色性肾细胞癌、集合管癌、分子定义的肾细胞癌和其他肾细胞癌,主要由生活方式、病史、环境和遗传风险等致病因素引起[3]。目前肾癌的治疗方案主要是在早期癌症未转移时进行手术切除,但手术后极有可能发生转移,五年生存率比较低[4]。涉及手术、放疗和化疗的传统治疗方法存在重大缺陷,许多患者仍然面临着复发的结果[5-7]。目前,免疫细胞疗法成为癌症治疗的新型治疗方案。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)作为一种细胞表面受体蛋白,在被嵌入免疫细胞膜后,使免疫细胞具备靶向特定抗原蛋白的能力,CAR的结构由细胞外靶抗原结合域、 跨膜结合域和胞内结构域组成。细胞外靶抗原结合域主要负责识别并特异性结合抗原,识别位点为单克隆抗体的单链可变片段(scFv),跨膜结合域负责将CAR的细胞外结构域与细胞内结构域连接起来,胞内结构域由信号转导结构域和共刺激信号结构域构成[8],主要负责给T细胞提供激活信号。以嵌合抗原受体T细胞(chimericantigen receptor T cell,CAR-T)为主的免疫细胞治疗对某些B细胞白血病或淋巴瘤亚群有明显的临床反应[9],但研究发现其在实体瘤的应用中仍然存在很大的局限性,这与肿瘤微环境的抑制性和实体瘤本身的异质性有关[10]。一方面,因为肿瘤免疫微环境十分复杂,实体瘤肿瘤微环境相比转移性肿瘤微环境,具有更强的免疫抑制特性,免疫抑制细胞或抑制因子会限制T细胞的免疫杀伤反应[11-12];另一方面,实体瘤具有高度异质性,对靶向单一抗原的CAR-T细胞疗法有很大的限制,免疫细胞向病灶部位的募集减少,同时减少T淋巴细胞对肿瘤的浸润程度。目前,嵌入CAR分子的巨噬细胞(CAR-macrophage,CAR-M)有望突破实体瘤的治疗[13],通过分泌促炎型细胞因子改变肿瘤微环境,从而更好地靶向吞噬肿瘤细胞,同时还能将肿瘤抗原提呈给T细胞,募集和激活T细胞对肿瘤的免疫反应[14]。CD70分子是一种跨膜蛋白,属于肿瘤坏死因子超家族[15],在肾透明细胞癌中呈高表达状态,被认为是肾癌的特异性标志物[16-17],靶向CAR-M并有效杀伤CD70高表达的肾癌细胞,是当前肾癌治疗的一个新策略。本研究拟构建靶向人CD70蛋白的CAR-M,探讨 CAR-M对表达CD70的肾癌细胞的杀伤作用,为CAR-M治疗肾癌的临床应用提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 肾癌细胞系(ACHN、786-O、OS-RC-2)和小鼠巨噬细胞RAW264.7购自武汉普诺赛生物科技有限公司。RAW264.7细胞培养于DMEM高糖培养基,肾癌细胞系(ACHN、786-O、OS-RC-2)培养于RPMI-1640培养基培养,培养基中均加入10%胎牛血清及1%青-链霉素溶液,置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

1.1.2 主要试剂和实验仪器 DMEM高糖、RPMI-1640培养基、胎牛血清均购自美国Gibco公司,慢病毒促感染试剂、CD70-CAR慢病毒、阴性对照病毒购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司,qRT-PCR引物购自广州生工股份有限公司,流式抗体APC Rat Anti-CD11b购自美国BD公司,RNA快速提取试剂盒购自上海奕杉生物科技有限公司,反转录试剂盒和SYBR Green购自日本TaKaRa公司,FACS Canto Ⅱ流式细胞仪购自美国BD公司,实时荧光定量PCR仪购自Roche公司。

1.2 方法

1.2.1 数据库分析 GEPIA数据库得到肾癌细胞系相关资料,分析CD70在人体肿瘤组织中的表达情况。

1.2.2 抗CD70 CAR载体构建及鉴定 CD70 scFv序列来源于之前的文献[18-19],我们通过基因重组技术将抗CD70-scFv、CD8α、4-1BB和CD3zeta合成DNA序列靶向CD70的CAR基因片段。重组质粒构建完成后将其转化入大肠杆菌,提取质粒后用BamH1内切酶进行酶切、琼脂糖凝胶鉴定后送检测序验证并留存(此质粒命名为CD70-CAR慢病毒质粒),对照组(不含人CD70 scFv序列,NC-CAR)慢病毒采用相同操作验证。

1.2.3 慢病毒感染构建CAR-M 于96孔板每孔铺1.0×104个RAW264.7细胞,培养24 h后,每孔加入MOI为50的慢病毒稀释液和促感染试剂,感染12～16 h后,观察细胞状态。若细胞状态良好,在24 h内更换新鲜培养基,于72～96 h后,在荧光显微镜下观察细胞,看绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达。

1.2.4 流式多克隆分选CAR-M并用qRT-PCR检测感染效率 扩培慢病毒感染后的CAR-M后,胰酶消化,制备成单细胞悬液,PBS清洗,流式分选仪筛选出GFP阳性细胞,并用流式检测GFP阳性率。用RNA快速提取试剂盒提取CD70-CAR-M和NC-CAR-M的RNA,逆转录成cDNA,采用SYBR Green进行qRT-PCR检测人CD70-CAR基因的表达情况。引物序列如下:CD70-CAR正向引物序列: 5′-TCGCTCCCGTTTCTCTGTTG-3′,反向引物序列:5′-CTTCTCGGCTTTCCCCCCAT-3′;CD70正向引物序列:5′-AGGAGGGCCATCTGCGTAT-3′,反向引物序列:5′-AGGCGCTGTAATGCCACTG-3′;GAPDH正向引物序列:5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,反向引物序列:5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.2.5 CD70-CAR-M对肾癌细胞系类器官的体外杀伤实验 将1.0×104个肾癌细胞加入96孔V型细胞培养板进行3D悬浮培养48 h,使细胞聚合成球体,拍照记录球体变化,第3天以1∶1的比例分别加入NC-CAR-M和CD70-CAR-M。共培养3天后,显微镜拍摄记录白光和荧光图片,小心取出类器官,用Accutase消化液在37 ℃消化30 min,期间用移液器不断吹打,使其尽可能消化成单细胞悬液,PBS清洗,1 000 rpm离心5 min,加入5 μL CD11b抗体,混匀放置冰上,避光孵育30 min,再次用PBS清洗,洗去抗体,加入200 μL PBS,流式细胞仪上机检测荧光。检测结果采用FlowJo软件分析。

1.2.6 Transwell共培养实验 将3.0×105个RAW 264.7、CD70-CAR-RAW264.7和NC-CAR-RAW264.7分别接种在Transwell小室底面培养,加入高糖DMEM培养基,将3.0×104个786-O接种在小室内,加入RPMI-1640培养基,小室内外培养基液面齐平,共培养3天后,收集RAW264.7、NC-CAR-RAW264.7和CD70-CAR-RAW264.7细胞,提取RNA并逆转录进行qRT-PCR检测巨噬细胞的表型变化。

1.3 统计学方法

采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 9.0,均进行3次重复实验,取其均数进行统计分析。符合正态分布的组间采用独立样本t检验,P值<0.05为差异具有统计学意义(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001)。

2 结 果

2.1 CD70分子在肾癌细胞系中高表达

GEPIA数据库中显示CD70在肾癌中表达水平显著高于其他癌症类型,但是对患者的生存率无明显影响。这些结果提示CD70可能为肾透明细胞癌的诊断标记物及识别靶点(图1A～C),通过qRT-PCR验证发现相较于ACHN和OS-RC-2,786-O的CD70表达水平最高 (图1D),提示CD70可以作为肾透明细胞癌特异性的作用靶点。

图1 CD70在不同癌症中的表达情况

2.2 设计和构建人CD70-CAR慢病毒表达质粒

慢病毒载体利用的是pLV-EF1α-EGFP-WPRE质粒,由EF1α作为启动子,并同时表达GFP(图2A)。CD70-CAR的基因片段组成依次为:CD8α信号肽、CD70-scFv、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、CD28、4-1BB和CD3zeta分子信号分析(图2B)。NC-CAR序列由慢病毒空载体构建,GFP通过P2A链接和CAR的序列链接,目的是让表达CAR的细胞会同时表达绿色荧光,用于后期的鉴定和筛选。

图2 慢病毒载体质粒和CD70-CAR结构示意图

2.3 成功构建CD70-CAR-M细胞

利用滴度MOI为50的对照和CD70-CAR慢病毒感染小鼠巨噬细胞RAW264.7,制备NC-CAR-M和CD70-CAR-M,荧光显微镜下可见,NC-CAR-M和CD70-CAR-M带有绿色荧光(图3),经过流式分选出GFP阳性细胞培养后,用流式细胞术检测 NC-CAR和CD70-CAR慢病毒的感染效率可达80%以上(图4A～B)。通过qRT-PCR检测了CD70-CAR基因在NC-CAR-M和CD70-CAR-M中的表达情况,我们发现其在CD70-CAR-M中特异性高表达,证明CD70-CAR-M细胞构建成功(图4C)。

图3 CD70-CAR慢病毒感染RAW264.7细胞

图4 流式和qRT-PCR检测CD70-CAR-M

2.4 嵌入CD70-CAR分子引起巨噬细胞的标志基因改变

将Transwell小室放入六孔培养板中,上室内培养786-O细胞,下室内培养巨噬细胞,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。共培养3天后,收集下层巨噬细胞并提取其RNA逆转录后进行qRT-PCR检测。我们发现相较于NC-CAR-M组,CD70-CAR-M组的TNF-α显著性上调而TGF-β显著性下调(图5),说明巨噬细胞表达CD70的CAR后向促炎型巨噬细胞方向分化。

图5 qRT-PCR检测CAR-M中细胞因子的表达水平变化

3D细胞培养利用V型细胞培养板,是一种可以模拟细胞在体内的生长状况及环境,使细胞在体外条件下进行三维生长的培养方法,能更加准确的检测CD70-CAR-M的杀伤效果。我们将1.0×104个不同类型的肾癌细胞,包括786-O、ACHN和OS-RC-2分别铺于96孔V型细胞培养板,培养两天后,观测到细胞形成球形肿瘤类器官。在第3天按1∶1的比例分别加入NC-CAR-M和CD70-CAR-M细胞继续培养,共培养5天后,在光学和荧光显微镜下观察肿瘤球体的形态变化(图6)。和加入了NC-CAR-M相比,加入CD70-CAR-M的肿瘤球体结构更加松散,提示CD70-CAR-M巨噬细胞能更好地浸润到CD70表达高的靶点肿瘤球体内部结构,具有更好的杀伤效果。共培养后将肿瘤类器官解离成单细胞悬液并计数,流式检测出巨噬细胞所占比例(图7),计算肿瘤细胞存活数量,发现相比对照组,786-O的细胞数量明显减少,说明CD70-CAR-M对786-O有明显的杀伤效果。

图6 和CAR-M共培养后不同肾癌细胞的形态

图7 CD70-CAR-M显著降低肾癌细胞的数量

3 讨 论

肾癌包括多种不同类型,具有不同的组织学、临床过程和治疗反应的特征,主要作为实体瘤治疗,具有一定的困难性,因此,找到更为创新有效的肾癌治疗方法尤为重要,目前研究表明免疫细胞疗法在治疗肿瘤中具有很大的前景。

过继细胞疗法是一种针对癌症的细胞免疫疗法,利用来自人体自身免疫系统的细胞来消除癌症,目前主流和新兴的细胞免疫疗法包括TIL、TCR-T、CAR-T、CAR-NK、CAR-M、DC、iNKT等。CAR免疫细胞疗法是将患者的T细胞导入CAR,构建出稳定的CAR-T细胞,回输至患者体内,从而杀死肿瘤细胞。但CAR-T细胞对于一些实体瘤治疗效果并不理想[20],治疗实体肿瘤的CAR-T细胞治疗的主要挑战之一是CAR-T细胞渗透到肿瘤肿块中的效率低下。目前,研究表明嵌合抗原受体巨噬细胞疗法已经取得临床进展,HER2-CAR-M(CT-0508)是用人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor,HER2)为靶点,主要针对HER2阳性的实体瘤患者治疗,2020年7月,CT-0508细胞疗法获FDA批准开展I期多中心临床实验研究,2021年3月,CAR-M细胞疗法首次用于人体研究[21],Carisma公司完成首例靶向HER2的CAR-M细胞疗法(CT-0508)受试者给药。CAR-M在实体瘤治疗领域中带来了崭新的希望。

CD70是一种在恶性肿瘤和实体肿瘤中被调节的泛癌靶标,使其成为CAR细胞疗法具有吸引力的治疗靶标,在本研究中,构建了靶向CD70的CAR-M细胞系,在体外利用3D培养技术,充分验证了CAR-M的杀伤和吞噬效率,在3D培养过程中,我们发现,根据CD70表达水平的差异,CAR-M细胞对肾癌类器官有不同程度的浸润,共培养后786-O的结构更加松散,此外,在共培养后我们发现CD70-CAR-RAW264.7可以促使巨噬细胞增加TNF-α表达,同时减少TGF-β表达,使其向促炎型巨噬细胞分化,从而具备更充分的肿瘤杀伤微环境。靶向CD70的CAR-M构建为肾癌治疗提供了新的治疗途径,对786-O显现出有效的杀伤肾癌细胞的作用,综上所述,CAR-M在驱动实体瘤的抗癌免疫方面具有巨大潜力。然而CAR-M治疗也面临一些尚未解决的难题,巨噬细胞是细胞因子风暴的主要来源,可导致细胞因子释放综合征[22],由于巨噬细胞分布在全身,使用CAR-M可能会导致脱靶毒性并限制疗效。然而在本研究中,靶向CD70的CAR-M对ACHN和OS-RC-2杀伤作用不显著,在光学显微镜下观察到其吞噬作用不强,与之前报道的文献靶向HER2的CAR-M细胞疗法杀伤效果有一定的差异,一方面,这个结果或许跟CD70的scFv的序列级或者肿瘤细胞自身特性相关,另一方面,也可能和体外实验的条件相关,相比786-O,3D培养条件下的OS-RC-2成瘤效率不是很好。因此,需要进一步研究和优化CD70-CAR-M效率并确保其安全性。虽然CAR-M技术作为癌症免疫疗法仍处于发展的早期阶段,仍然存在很大的挑战,但巨噬细胞作为治疗剂的潜力仍在继续挖掘和探索,关于这一领域的新突破将对各种疾病的新疗法的发展产生重大影响。

总之,本研究结果表明CD70-CAR-M在治疗CD70阳性的肾癌上具有一定的临床潜力,并为实体瘤治疗带来了新的希望。

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