苗药花蝴蝶回调CIA模型鼠血细胞变化的初步研究

张庆忠,龙思芳,戚国平,魏胜兰,吴富小,朱启悦,韦小龙,周枝

类风湿关节炎(RA)是一种病因未明的慢性系统性疾病,其临床表现为手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症,可伴关节器官受累、畸形、功能丧失等症状,若控制不佳,10年内约35% RA患者丧失自由活动能力[1-2]。临床资料显示,血中淋巴细胞[3-4]、单核细胞[5-6]、红细胞[7-8]、血小板[9-10]等细胞以及相关指标[11]检测对RA的辅助诊断和作用机制研究有一定意义。苗药花蝴蝶,学名赤胫散,为蓼科蓼属植物,贵州省苗族民间草医常用此药治疗RA,效果较好[12],本课题组前期预实验效果也较好[13]。因此,结合RA相关血细胞文献资料,本实验研究苗药花蝴蝶回调胶原诱导关节炎(CIA)模型鼠外周血白细胞、淋巴细胞、单核细胞、淋巴细胞/单核细胞、红细胞、血细胞比容、血小板、平均血小板体积等指标,并初步探讨苗药花蝴蝶的作用机制。报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 苗药花蝴蝶药液:将采自本苗族地区的新鲜花蝴蝶全株约2 000 g,处理干净后于实验室水提3次,合并浓缩液后静置取上清液为本实验用苗药花蝴蝶药液。

1.1.2 实验试剂、用品及动物:第三军医大学动物实验中心提供的SPF级雄性SD大鼠40只,体质量(180±20)g[SCX-(军)2022-1031]。购自美国SIGMA公司完全弗氏佐剂(CFA)(2 mg/支)。牛Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)购自北京索莱宝科技有限公司。甲氨蝶呤片购自贵州鼎晟泰生物科技有限公司。希森美康(sysmex)自动血细胞分析仪等。

1.2 方法

1.2.1 建模CIA模型鼠:按照动物福利保护法进行实验(本校伦理委员会动物实验伦理审查表编号:20231013)。40只SD雄性大鼠,随机分为建模组32只和正常组8只。将CⅡ溶于0.1 g/ml醋酸溶液,制成浓度为1 mg/ml CⅡ溶液,摇床4 ℃过夜。次日将CFA与CⅡ溶液按体积比2∶1混合于冰上乳化成乳剂(即胶原诱导关节炎建模液)。所有建模组大鼠左右后足掌部皮内注射CIA建模液0.50 mg/只。

1.2.2 建模组大鼠分组:CIA建模后大鼠足关节炎指数评分≥3.5分,出现后足或前足踝关节明显肿胀、关节红肿等,视为建模成功[13]。将建模组大鼠随机分为花蝴蝶低剂量治疗组(花蝴蝶低组)、花蝴蝶高剂量治疗组(花蝴蝶高组)、甲氨蝶呤治疗组(甲氨蝶呤组)、CIA模型组(模型组),每组8只大鼠。

1.2.3 灌胃给药:各组行灌胃给药实验,根据民间用药经验和前期实验确定[12-13],花蝴蝶高、低组分别每天灌胃药液7.6 mg/kg、3.8 mg/kg,甲氨蝶呤组灌胃以1.04 mg/kg(每周2次),模型组和正常组大鼠均生理盐水灌胃,灌胃约35 d即可停止给药。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 大鼠足关节肿胀指数评分:CIA模型鼠建模成功的第1、4、8、12、16、20、24、28和32天,观察、评估和照相大鼠左右后足跖及相关组织、关节肿胀指数评分。

1.3.2 血液指标:末次给药第2天,腹腔注射20%乌来糖(6 ml/kg)麻醉[14]后,取股动脉全血3 ml/只并立即送贵州医科大学第三附属医院检验科检测外周血白细胞计数、淋巴细胞计数、单核细胞计数、淋巴细胞/单核细胞、红细胞计数、血细胞比容、血小板计数、平均血小板体积等指标。

1.3.3 足关节骨髓腔病理切片:麻醉大鼠(方法同“1.3.2”)后,取膝关节、趾关节等,并用4%多聚甲醇固定,即送黔南州人民医院病理科制作大鼠足关节病理切片(HE染色),后扫描切片为数字图像资料备用。

2 结 果

2.1 各组大鼠足关节肿胀指数评分比较 模型组大鼠足关节肿胀指数评分明显高于花蝴蝶低组、花蝴蝶高组、甲氨蝶呤组和正常组(P<0.01);正常组、甲氨蝶呤组、花蝴蝶高组、花蝴蝶低组足关节肿胀指数评分比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 各组大鼠足关节肿胀指数评分比较分)

2.2 各组大鼠外周血白细胞计数、淋巴细胞计数、单核细胞计数、淋巴细胞/单核细胞、红细胞计数、血细胞比容、血小板计数、平均血小板体积比较 与其他各组比较,模型组大鼠外周血白细胞计数、淋巴细胞计数、单核细胞计数、红细胞计数、血细胞比容、血小板计数检测指标均升高(P<0.01),而模型组大鼠外周血淋巴细胞/单核细胞、平均血小板体积均降低(P<0.01)。正常组、甲氨蝶呤组、花蝴蝶高组、花蝴蝶低组外周血相关检测指标各组间比较差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 各组实验鼠外周血白细胞、淋巴细胞等8项指标检测结果比较

2.3 各组大鼠膝关节病理切片结果比较 与其他各组比较,模型组大鼠膝关节骨髓腔淋巴细胞、单核细胞等评分均升高,脂肪细胞评分均降低(P<0.01)。正常组、甲氨蝶呤组、花蝴蝶高组、花蝴蝶低组大鼠膝关节骨髓腔淋巴细胞、单核细胞增生和脂肪细胞减少各组间比较差异无统计学意义(P>0.05),见表3。染片结果见图1。

图1 各组实验鼠膝关节骨髓腔病理切片图(HE染色,倍数×70 μm)

表3 各组实验鼠膝关节骨髓腔淋巴细胞、单核细胞和脂肪细胞变化病理评分比较分)

3 讨 论

3.1 苗药花蝴蝶对CIA模型鼠白细胞变化的回调作用 从表2可知,苗药花蝴蝶能显著回调CIA模型鼠外周血白细胞、淋巴细胞、单核细胞等指标升高,淋巴细胞/单核细胞比值降低。结合文献资料报道“外周血淋巴细胞升高、淋巴细胞/单核细胞比值降低是RA的临床多指标联合辅助诊断措施[3-4,11,15]”“大量单核细胞/巨噬细胞显著导致RA[5]”等,提示苗药花蝴蝶对CIA模型鼠外周血细胞的显著回调作用可用于RA患者的临床治疗,且可能对缓解淋巴细胞、单核细胞升高和淋巴细胞/单核细胞比值降低型RA患者的作用明显。同时,苗药花蝴蝶能显著回调CIA模型鼠膝关节骨髓腔淋巴细胞、单核细胞等显著弥漫性增生。表3结果显示,CIA模型鼠骨髓腔产生大量淋巴细胞、单核细胞等,导致外周血相关血细胞增多及关节炎症,苗药花蝴蝶可能通过回调CIA模型鼠骨髓淋巴细胞、单核细胞等大量增生达到缓解CIA模型鼠发展趋势。因此推测,本省民族民间使用苗药花蝴蝶治疗RA的初步作用机制之一可能是该药通过缓解RA患者骨髓淋巴细胞、单核细胞等升高和淋巴细胞/单核细胞比值降低,回调了RA患者外周血相关血细胞的变化,最终达到治疗RA目的。

3.2 苗药花蝴蝶回调红细胞和血细胞比容作用 本研究结果表2显示,苗药花蝴蝶能显著回调CIA模型鼠外周血红细胞、血细胞比容等升高。结合资料报道“红细胞相关指标水平与传统反映RA活动度的炎症呈正相关[7]”,提示苗药花蝴蝶的回调作用可用于缓解RA患者外周血红细胞、血细胞比容等指标,这也可能是苗药花蝴蝶治疗RA患者的作用机制之一。

3.3 苗药花蝴蝶回调CIA模型血小板作用 本研究结果表2显示,苗药花蝴蝶能显著回调CIA模型鼠外周血血小板升高和平均血小板体积降低。结合资料研究结果“RA患者外周血血小板参数变化与疾病活动具有相关性”[8-9,16]提示,苗药花蝴蝶的回调作用可用于缓解RA患者外周血小板和平均血小板体积,这可能是苗药花蝴蝶治疗RA患者的作用机制之一。

综上所述,苗药花蝴蝶可能通过回调CIA模型鼠骨髓淋巴细胞、单核细胞、红细胞、血细胞比容、血小板等指标升高和平均血小板体积、淋巴细胞/单核细胞比值降低,回转CIA模型鼠外周血相应血细胞变化,最终达到缓解CIA模型鼠症状。这可能是苗药花蝴蝶治疗RA的初步作用机制,应进一步研究。

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