一株鸡源粪肠球菌的分离鉴定

陈松，马启超，鲍佳茵，潘保革，许利军，刘华格，王学静,★，陈立功★

（1.河北农业大学动物医学院，河北保定 071001；2.保定市畜牧工作站，河北保定 071001；3.河北省畜牧兽医研究所，河北保定 071001）

近年来河北部分地区肉鸡关节囊肿病发病率有逐渐增多的趋势， 患病肉鸡饲料利用率下降，淘汰率增高，给肉鸡养殖造成了较大的经济损失。 肉鸡腿病的发病原因很多，其中细菌感染是主要原因之一。 肉鸡关节囊肿中分离的细菌包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌，但尚无关于分离粪肠球菌的报道。 通常认为，细菌所携带的毒力因子在疾病发生过程中起着至关重要的作用，已报道的粪肠球菌毒力因子主要包括溶血素（cyl）、表面蛋白（esp）、明胶酶E（gelE）、聚集物质（asal）、心内膜炎抗原（efaA）、胶原蛋白黏附素（ace）、透明质酸（Hyl）。 笔者自保定某鸡场患关节囊肿肉鸡的关节液中分离鉴定到一株粪肠球菌，该结果可为肉鸡关节囊肿的防控提供基础。

1 材料与方法

1.1 生物材料

于2022 年6 月从保定某鸡场采集肉鸡关节囊肿液；粪肠球菌质控菌（BNCC 102668）购自北京北纳创联生物技术研究院。 BALB/c 小鼠购于河北伊维沃生物科技有限公司。

1.2 主要试剂

甘露醇氯化钠培养基、 胰蛋白胨大豆肉汤购自北京奥博星生物技术有限责任公司；革兰氏染色液购自山东康华生物医疗科技股份有限公司；DL2000 DNA Marker、Premix TaqTM购自宝生物工程（大连）有限公司；快速DNA 提取检测试剂盒购自北京天根生物科技有限公司；50×TAE缓冲液、琼脂糖购自索莱宝科技（北京）有限公司。

1.3 细菌分离鉴定

1.3.1 细菌分离纯化与染色镜检

2 毫升胰蛋白胨大豆肉汤与500 微升肉鸡关节囊肿液混合， 置37℃震荡培养24 小时；取肉汤培养物在甘露醇氯化钠琼脂平板上分区划线，琼脂平板置于37℃培养18～36 小时；挑取单个菌落在甘露醇氯化钠琼脂平板上再次纯化。判定已纯化的细菌进行革兰氏染色、镜检、拍照。

1.3.2 细菌16S rDNA 遗传进化分析

扩增细菌16S rDNA 的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，扩增片段大小为1400bp。 用快速DNA 提取检测试剂盒提取分离纯化的细菌DNA。 PCR 扩增体系依照快速DNA提取检测试剂盒进行， 扩增程序：95℃预变性5分钟；95℃变性30 秒，55℃退火30 秒，72℃延伸1 分钟，30 个循环；72℃终延伸10 分钟。

PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR 阳性产物测序结果进行BLAST 比对。 应用DNAStar 分析软件对分离细菌的16S rDNA 基因序列与9 株粪肠球菌参考菌株 （基因登录号ON778619.1、OP359300.1、OP359284.1、OQ405977.1、KJ726743.1、KP317676.1、OQ406010.1、OQ405593.1、MT604811.1） 进行同源性分析； 基于细菌的16S rDNA 基因序列，用MEGA7 软件绘制遗传进化发生树， 并进行遗传进化分析。

1.3.3 细菌毒力基因检测

参照文献设计8 对粪肠球菌毒力基因（ace、asal、gelE、efaA、cylA、hyl、Agg、esp） 以上引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。 PCR 扩增体系同上。 扩增程序：56℃退火，其余同上。

1.3.4 动物回归试验

将30 只SPF 鸡随机分成a、b 两组，每组15只。使菌液浓度达到每毫升样品中含有1×108的细菌群落。 a 组经跗关节注射1 毫升粪肠球菌，b组经跗关节注射1 毫升灭菌生理盐水。 分别隔离饲养观察42 天。 接种后每天观察记录SPF 鸡的死亡情况及跗关节处是否有肿胀， 死亡SPF鸡及时进行病理剖检及细菌分离培养，同时将b组鸡进行剖检及细菌分离培养。

2 结果

2.1 细菌分离纯化及染色结果

自保定某鸡场采集的肉鸡关节囊肿液中分离纯化1 株细菌 （命名为HBBDYX E.faecalis株）。 HBBDYX E.faecalis 株分离菌在甘露醇氯化钠琼脂平板上生长呈浅粉色、边缘整齐、圆形的小菌落，光镜下该细菌呈革兰氏阳性、短链状球菌。

2.2 细菌16S rDNA 鉴定结果

HBBDYX E.faecalis 株分离菌的PCR 扩增产物电泳可见大小约为1400bp的目的条带 （图1）；HBBDYX E.faecalis 株分离菌16S rDNA 序列与粪肠球菌参考株（ON778619.1）的同 源 性 达99.9%。遗传进化分析结果（图2）表明，HBBDYX E.faecalis 株分离菌与粪肠球菌参考株（ON778619.1）亲缘关系最近，因此判定该分离菌属于粪肠球菌。

图1 细菌16S rDNA PCR 产物电泳结果

图2 基于16S rDNA 基因序列生成的遗传进化树

2.3 细菌毒力基因检测结果

成功地扩增出了HBBDYX E.faecalis 株分离 菌 的ace 基 因、asal 基 因、gelE 基 因、efaA 基因； 但未检出cylA 基因、hyl 基因、Agg 基因、esp基因（图3）。

图3 粪肠球菌毒力基因检测结果

2.4 动物回归试验结果

a 组SPF 鸡于接种后12 天发病， 表现精神沉郁（15/15）；接种后7 天、8 天、12 天分别死亡1 只，死亡率为20.00%（3/15）；接种后20 天跗关节见肿胀（1/12），到接种后42 天共有8 只鸡见跗关节肿胀，跗关节腔发现大量白色黏液，病变率为66.67%（8/12）， 自a 组死亡鸡和关节肿胀的鸡均可回收到粪肠球菌。b 组鸡观察期内未见发病死亡，人工处死后均无肉眼可见病变，细菌分离结果呈阴性。

3 讨论

粪肠球菌多分布于粪便、尿液中，但本研究自肉鸡关节囊肿液中分离纯化得到1 株粪肠球菌。 目前，国内对肉鸡关节病中分离菌的报道多集中于葡萄球菌、大肠杆菌、沙门菌，未见分离到粪肠球菌的报道。本试验从河北保定某肉鸡养殖场患有关节囊肿的肉鸡中分离到1 株粪肠球菌， 试验结果表明该分离菌株携带4 种毒力基因， 且对SPF 鸡具有致病性。 我国作为养禽大国，兽药使用较多。 兽用的抗生素在禽病防治和提高养殖效益上十分重要。由于抗生素的使用不规范等原因导致细菌耐药性增高，给禽病防治工作带来了很大的难度。笔者后期拟继续开展鸡源粪肠球菌的分离鉴定及分离菌的耐药性监测，以为肉鸡关节囊肿的防治提供理论参考。