参仙升脉口服液化学成分的UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS快速分析＊

宗时宇，狄志彪，刘琪琪，黄壮壮，张 红，李 晔，刘 峰，刘 洋＊＊

（1.陕西省中医药研究院中药研究所 西安 710003；2.陕西中医药大学药学院 咸阳 712046；3.陕西步长制药有限公司 西安 710075）

参仙升脉口服液是我国第一个专门治疗缓慢性心律失常的专利中成药，具有温补心肾、活血化瘀的作用[1]。现代临床上常用于治疗轻、中度窦房结心动过缓（心率>50次）和轻度病态窦房结综合征不合并有室上性快速心律失常的心肾阳虚，寒凝血脉证。全方由红参、淫羊藿、补骨脂（盐炙）、枸杞子、麻黄、细辛、丹参、水蛭等八味中药组成。经查阅文献，仅发现参仙升脉口服液中单味药材的化学成分研究报道[2-5]。其中，红参是经人参蒸制干燥而成，主要有效成分为人参皂苷[6]，其特有成分为人参皂苷Rg3[2]；淫羊藿有效成分主要为淫羊藿总黄酮和淫羊藿多糖[7]；补骨脂主要成分为补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂二氢黄酮等[8]；枸杞子活性成分主要为多糖类[9]；麻黄主要成分为生物碱，含有麻黄碱、伪麻黄碱等[10]；细辛、丹参、水蛭的主要成分分别为木脂素类、丹参酮类、水蛭素[11-13]。

中药复方药味多，化学成分复杂，其疗效是药物中多种成分协同作用的结果[14]，单一中药成分的分析并不能够体现中药复方的整体性和化学成分的复杂多样性。尽管参仙升脉口服液的临床疗效显著，但缺乏系统的化学成分研究，其发挥药效的化学物质基础尚不明晰。且有个案报道服用参仙升脉口服液数天后患者出现肝功异常，而引起这一不良反应的机制也未明确[15-16]。超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS）具有高分辨率、高精度及快速分析等特点，可以提供可靠的化学结构鉴定信息，是目前复杂中药体系中化学成分快速鉴别的主要技术之一。本研究借助UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS 技术，阐明参仙升脉口服液的整体化学组分，为其进一步药效成分的明确、全面质量控制及安全性评价提供实验依据。

1 材料

1.1 仪器

Ultimate 3000 型超高效液相色谱系统和Q Exactive Focus 型质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Mill-Q 超纯水机（美国Millipore 公司）；SQP 型电子分析天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）。

1.2 药物与试剂

参仙升脉口服液（批号181202）由陕西步长制药有限公司提供；芦丁对照品（批号100080-201811）购自中国食品药品检定研究院，补骨脂苷对照品（批号CHB-B-163）、异补骨脂苷对照品（批号CHB-Y-280）、补骨脂酚对照品（批号CHB-B-099）购自成都克洛玛生物科技有限公司，补骨脂素（批号110739-200310）、异补骨脂素（批号0738-200108）购自中国药品生物制品检定所，所有对照品纯度均>98%；甲醇为色谱级，甲酸为质谱级（美国Thermo Fisher Scientific公司）；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备

称取芦丁、补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂酚、补骨脂素、异补骨脂素对照品约10 mg，精密称定，分别置于10 mL容量瓶，加甲醇溶解并定容至刻度，作为对照品贮备液；再取各对照品贮备液用甲醇稀释至适宜浓度，即得各对照品溶液。

2.1.2 样品溶液的制备

取1 mL 参仙升脉口服液内容物于10 mL 容量瓶内，用甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22 µm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2 检测条件

2.2.1 色谱条件

Thermo Accucore aQ C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，2.6 µm）；流动相采用甲醇（A）和0.1%甲酸水（B）梯度洗脱，洗脱程序为0-13 min，5%-60% A；13-27 min，60%-95% A；27-30 min，95% A。流速0.3 mL∙min-1；进样量2 µL；柱温30℃。

2.2.2 质谱条件

离子源为加热电喷雾离子源（H-ESI），喷雾电压为3.5 kV，鞘气（N2）流量40 arb，辅助气流量10 arb，辅助加热器温度350℃，毛细管温度320℃，S-lens射频水平50，自动增益控制（AGC）106。离子检测模式采用正、负离子切换，扫描模式Full MS/dd-MS2，Full MS 分辨率为70000，dd-MS2分辨率为35000；扫描范围m/z120-1800，碰撞能量30 eV、50 eV、70 eV。

2.3 数据处理

根据质谱精确相对分子量信息，选择一级准分子离子峰质荷比实测值与理论值误差小于5 ppm 的分子与自建的参仙升脉口服液化学成分数据库信息进行匹配，初步推测化合物信息。采用Xcalibur 2.0软件进一步对目标化合物色谱峰及其二级碎片离子信息进行提取，并结合相关化学成分数据库和文献信息对目标化合物进行鉴定和确证。

3 结果

利用UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS，通过对不同离子模式下的供试品基峰总离子流图（图1）对比可以看出，参仙升脉口服液在正负离子模式下响应均较好，在0-30 min 内均有密集的响应信号，大部分化合物均有出峰，随着流动相极性的降低，化合物出峰变少，表明参仙升脉口服液中主要以极性化合物为主。从参仙升脉口服液中共检测到160 种化学成分，其中响应度高，具有二级碎片离子的化学成分有62 种，其他成分因自身含量低或离子化能力弱，从而未发生裂解产生相应的碎片离子，具体化合物信息见表1。

表1 参仙升脉口服液化学成分的UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS 鉴定结果

图1 参仙升脉口服液UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS 总离子流图

续表

3.1 黄酮类

绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，本研究从参仙升脉口服液中鉴定的黄酮类成分共有29种，主要包括淫羊藿苷、宝藿苷Ⅶ、朝藿定A 和大豆苷等。以114 号代表性化合物淫羊藿苷质谱裂解过程为例，在正离子模式下可见准分子离子峰m/z677.24 [M+H]+，拟合其分子式为C33H39O15，在高能碰撞离子作用下获得主要二级碎片离子m/z531.19 [M+H-C6H9O4]+，m/z369.13 [M+H-C6H9O4- C6H10O5]+，相应质谱裂解途径见图2。

图2 淫羊藿苷可能裂解途径

3.2 有机酸类

从参仙升脉口服液中鉴定的有机酸类成分有24 种，主要包括丹参素、咖啡酸、异亮氨酸、烟酸和琥珀酸等。以44 号代表性化合物丹参素质谱裂解过程为例，在负离子模式下可见准分子离子峰m/z197.05[M-H]-，拟合其分子式为C9H10O5，在高能碰撞离子作用下获得主要二级碎片离子m/z135.05 [M-H-H2OCO2]-，m/z123.05 [M-H-C2H2O3]-，相应质谱裂解途径见图3。

图3 丹参素可能裂解途径

3.3 生物碱类

从参仙升脉口服液中鉴定的生物碱类成分有21种，主要包括麻黄碱、甲基麻黄碱、木兰花碱、肌苷和腺苷等。以47 号代表性化合物麻黄碱质谱裂解过程为例，在正离子模式下可见准分子离子峰m/z166.12[M+H]+，拟合其分子式为C10H15NO，在高能碰撞离子作用下获得主要二级碎片离子m/z121.06 [M+HC2H7N]+，m/z103.05 [M+H-C2H7N-H2O]+，相应质谱裂解途径见图4。

图4 麻黄碱可能裂解途径

3.4 萜类

从参仙升脉口服液中鉴定的萜类成分有19种，主要包括丹参酮IIA、表丹参隐螺内酯和α-蒎烯等。以147号代表性化合物丹参酮IIA 质谱裂解过程为例，在正离子模式下可见准分子离子峰m/z317.11 [M+Na]+，拟合其分子式为C19H18O3，在高能碰撞离子作用下获得主要二级碎片离子m/z69.07 [M+Na-C14H9O3Na]+，m/z67.05 [M+Na-C14H9O3Na-H2]+，相应质谱裂解途径见图5。

图5 丹参酮ⅡA可能裂解途径

3.5 苯丙素类

从参仙升脉口服液中鉴定的苯丙素类成分有15种，主要包括补骨脂苷、异补骨脂苷、补骨脂素和异补骨脂素等。以65 号代表性化合物补骨脂苷质谱裂解过程为例，在正离子模式下可见准分子离子峰m/z389.08 [M+Na]+，拟合其分子式为C17H18O9，在高能碰撞离子作用下获得主要二级碎片离子m/z227.03 [M+Na-C6H10O5]+，m/z185.04 [M+Na-C11H8O4]+，相应质谱裂解途径见图6。

图6 补骨脂苷可能裂解途径

3.6 皂苷类

从参仙升脉口服液中鉴定的皂苷类成分有12种，主要包括人参皂苷Rg1、人参皂苷Re 和人参皂苷Rb1等。以105 号代表性化合物人参皂苷Rg1 质谱裂解过程为例，在正离子模式下可见准分子离子峰m/z823.48 [M+Na]+，拟合其分子式为C42H72O14，在高能碰撞离子作用下获得主要二级碎片离子m/z643.42 [M+Na-C6H12O6]+，m/z203.05 [M+Na-C36H60O8]+，相应质谱裂解途径见图7。

图7 人参皂苷Rg1可能裂解途径

3.7 其他类

此外，本研究还从参仙升脉口服液中鉴定出了多种其他类化合物，包括10 种酯类、9 种糖类、8 种挥发油类、7种酚类和6种酮类，具体结果见表1。

4 讨论

参仙升脉口服液由八味中药组成，化学组分十分复杂，其药效与不良反应物质基础均不明晰。本研究采用UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS 技术，正负离子切换扫描，较为全面地对参仙升脉口服液中的化学成分进行了快速、系统的分析，首次从中鉴定出160个化学成分。参仙升脉口服液的化学成分结构类型主要包括黄酮类、皂苷类、生物碱类、有机酸类、苯丙素类、萜类等。其中，黄酮类、皂苷类、生物碱类和萜类化合物主要归属于药材淫羊藿、红参、麻黄和丹参。

现代药理学研究表明，黄酮[38]、生物碱和皂苷类化合物[39]对心血管疾病具有显著的药理活性；某些苯丙素[40]和有机酸类成分如咖啡酸、绿原酸、原儿茶酸等能抑制血小板聚集、抗血栓[41]；萜类化合物可能具有一定的强心作用[42]。已有研究表明红参、淫羊藿和丹参具有保护心血管、抗心律失常作用，景雅婷等[43]研究发现人参皂苷Rb1可通过抑制TGF-β通路和Periostin蛋白表达，有效防治心力衰竭；刘守义等[44]研究发现淫羊藿总黄酮苷可以阻滞β 受体，减少Na+、Ca2+内流，从而降低自律性；Maione 等[45]研究表明丹参酮ⅡA 是潜在的改善血液微循环，预防脑血管疾病的有效药物，丹参酮ⅡA 能升高心型脂肪酸结合蛋白水平，降低心肌组织缺血修饰白蛋白水平，对心肌缺血再灌注损伤及心律失常具有良好的防治作用[46]。补骨脂中香豆素类成分也具有保护心血管系统作用，补骨脂素能够减少TNF-α 诱导人脐静脉内皮细胞的组织因子释放，降低血栓形成风险[47]。此外，研究表明，组方药材细辛的主要化学成分黄樟醚，可致肝脏毒性[48]。以上提示参仙升脉口服液发挥治疗缓慢性心律失常的作用和引发不良反应与这些成分有着密切的联系。本研究初步阐明了参仙升脉口服液的化学物质结构，为其进一步药效物质的明确及全面的质量控制提供了实验研究基础。