褪黑素对双酚A 损伤猪卵丘细胞发育的影响

郑璐璐 ，王 敏 ，武玉玉 ，刘开鑫 ，崔茂盛

（1.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300380；2.天津市农业科学院畜牧兽医研究所，天津 300381）

双酚A（BPA）是环境中内分泌干扰物（EDCs）之一，在食品包装、个人护理用品、收银机收据和医疗设备中随处可见，对机体产生负面影响。BPA作为一种弱外源性雌激素，能够结合经典的核雌激素受体ERα和ERβ并激活它们，这种激活会干扰正常的激素信号传导，影响卵巢功能和卵泡发育，从而导致月经周期不稳定和生殖问题。BPA还会干扰子宫内膜的正常发育和增殖，导致子宫内膜异位症、不孕症和胚胎着床等问题，对雌性生殖系统产生严重的毒性影响。到目前为止，BPA已经在水生环境、污水、自来水、土壤、灰尘和空气中被检测到，对人类和动物都构成了威胁。

褪黑素（M T）是一种吲哚胺，主要由松果体分泌和合成，褪黑素及其代谢物除了能发挥影响生物节律、减少炎症状态等多重作用外，还具有间接抗氧化剂和强大的自由基直接清除剂的功能。褪黑素可以维持卵母细胞的促氧化-抗氧化平衡，从而保护雌性配子免受氧化损伤，调节健康的卵泡生成。褪黑素存在于卵泡液中，通过激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）刺激颗粒细胞增殖。许多体外研究在培养基中添加褪黑素，以便促进卵母细胞成熟、卵母细胞受精和胚胎发育。有研究者认为，MT作为一种抗氧化因子在猪胚胎体外培养中不可或缺。实验表明，MT能够缓解BPA诱导的超氧化物对细胞的损伤。

国内外相关研究进展显示，虽然研究者在MT缓解BPA对生物机体或细胞损伤方面做了一些探讨，但在猪卵母细胞体外成熟过程中，针对MT对BPA诱导的猪卵丘细胞损伤的作用方面研究尚少。本实验室前期试验确定在卵母细胞体外培养过程中，BPA导致卵丘细胞氧化和凋亡，降低卵丘细胞的扩展和连接水平。本研究以正常成熟培养的猪卵丘细胞为对照组，设置BPA组和BPA+MT组，BPA浓度根据本实验室以往浓度为基础进行选择，从细胞形态、基因等层面深入探讨MT对BPA损伤猪卵丘细胞发育的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂配制

洗卵液：HEPES缓冲液中添加0.3%的BSA。成熟培养液：碳酸氢钠 0.015 g，葡萄糖0.027 5 g，聚乙烯醇0.05 g，丙酮酸钠0.005 g，庆大霉素0.000 5 g，TCM-199培养基，10%的卵泡液（PFF），1 μg/mL促卵泡素（FSH）、促黄体素（LH），10 ng/mL表皮生长因子（EGF）。根据试验设计添加75 μmol/L BPA，添加10-7mol/L的MT。

1.2 主要耗材

Medium199购于美国Gibco公司；活性氧检测试剂盒、线粒体红色荧光探针试剂盒、谷胱甘肽试剂盒和丙二醛试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司；反转录试剂盒、qRT-PCR试剂盒购于美国GeneCopoeia公司；在无特殊说明的情况下，细胞培养所需其他试剂均购自Sigma公司。

1.3 材料

将屠宰场采集的猪卵巢放入37℃的含有双抗的生理盐水中，1～3 h内运至实验室。

1.4 方法

1.4.1 猪卵母细胞的采集

将猪卵巢在含有双抗的生理盐水中清洗3次，用带有18号针头的10 mL一次性注射器抽取卵巢表面直径2～8 mm的卵泡中的卵子和卵泡液，置于10 mL的锥形离心管中，37℃水浴锅中静置10 min后吸走上清液，用洗卵液洗两次，在体式显微镜下挑选卵丘细胞三层以上胞质均匀的卵母细胞。

1.4.2 猪卵母细胞的培养与分组

对照组：COCs在成熟培养液中清洗3次后，置于100 uL的成熟培养液滴中，每滴30枚卵母细胞置于38.5℃、5%CO2的培养箱中培养44 h。BPA组：操作方法同对照组，置于100 μL添加75 μmol/LBPA的成熟液滴中，培养44 h。BPA+MT组：在添加BPA的成熟培养液中预处理18 h后转入添加10-7mol/L MT的成熟培养液滴中继续培养至44 h。

1.4.3 猪卵母细胞卵丘扩展指数

在CO Cs 体外成熟培养44 h后，用荧光显微镜观察并拍照，对卵丘扩展指数（Cumulus Expansion Index，CEI）进行分类统计，标准如下：0级：几乎未扩展；1级：只有外层1～2层卵丘细胞扩展；2级：外层卵丘细胞约有一半扩展；3级：卵丘细胞除放射冠外全部扩展；4级：所有卵丘细胞呈放射状扩展；卵丘扩展指数CEI计算公式：CEI =（0级数×0＋1级数×1＋2级数×2＋3级数×3＋4级数×4）÷总COCs个数。如图1所示。

图1 猪卵丘细胞分级

图2 MT 对BPA 暴露的卵丘扩展程度的影响

1.4.4 猪卵丘细胞的采集

将培养成熟的各组卵母细胞放在装有透明质酸酶的离心管中反复吹打40次左右去除卵丘细胞，转入操作液中在显微镜下将卵母细胞捡出放在操作洗盘里。将捡出卵母细胞后的剩余液体转移到无RNAse的1 mL离心管中，在3 500 rpm离心5 min，弃去上清液，加入PBS吹打清洗，重悬后3 500 rpm离心5 min，弃去上清液，做好标记。其他各组卵丘细胞均按此方法进行收集，收集完成后放入-80℃冰箱保存。

1.4.5 猪卵丘细胞总RNA提取及基因检测

每个组收集1×106个/mL卵丘细胞，使用RNeasy Micro Kit（5 0）微量试剂盒提取核糖核酸（R N A），使用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，采用All-inoneTMqPCR Mix试剂盒进行荧光定量PCR。待反应结束后将所有Ct值导出，参照内参基因，采用 2-△△Ct法计算出各目的基因mRNA的相对表达量。

1.4.6 引物设计及合成

本研究引物由生工生物工程股份有限公司设计并合成，检测基因包括细胞凋亡相关基因（Bax、Bcl-2）、氧化应激相关基因（CAT、SOD1）、细胞连接相关基因（Cx43、Cx45）、细胞扩展相关基因（Ptgs1、Ptgs2、Has2、Tnfaip6）引物序列见表1。

表1 荧光定量PCR 引物序列

1.4.7 统计学处理

所有试验数据均用均值±标准误表示。采用SPSS 26.0单因素方差分析（ANOVA）进行统计，用LSD、Duncan's检验法确定组间差异，P＜0.05为有统计学意义的结果。

2 结果

2.1 MT 对BPA 暴露的卵丘扩展程度的影响

卵母细胞成熟后对不同处理组的COCs在显微镜下进行拍照，根据CEI计算公式统计卵丘细胞的扩展指数。由表2所示，与对照组相比，BPA组卵丘细胞扩展指数显著降低（P＜0.05），BPA+MT组卵丘细胞扩展指数显著升高（P＜0.05），但仍显著低于对照组（P＜0.05）。

表2 MT 对BPA 暴露的卵丘扩展程度的影响

2.2 MT 对BPA 暴露后猪卵丘细胞CAT 基因表达的影响

卵母细胞体外成熟培养44 h后收集卵丘细胞检测抗氧化相关基因CAT、SOD1。结果由图3所示，BPA+MT组的CAT基因表达水平与对照组相比显著降低（P＜0.05），但仍显著高于BPA组（P＜0.05）。MT+BPA组的SOD1基因表达水平显著低于BPA组（P＜0.05），与对照组无明显差异（P＞0.05）。

图3 MT 对BPA 暴露的猪卵丘细胞CAT、SOD1 基因的影响

2.3 MT 对BPA 暴露后猪卵丘细胞调亡基因的影响

卵母细胞体外成熟培养44 h后收集卵丘细胞检测调亡相关基因Bax、Bcl-2。由图4可见，对照组的Bax基因表达量显著低于BPA组（P＜0.05），但仍显著高于BPA+MT组（P＜0.05）。BPA+MT组的Bcl-2基因表达量显著高于BPA组（P＜0.05），但与对照组无明显差异（P＞0.05）。与对照组相比，BPA组Bcl-2/Bax显著降低（P＜0.05），BPA+MT组Bcl-2/Bax与对照组相比显著升高（P＜0.05）。

图4 MT 对BPA 暴露的猪卵丘细胞调亡基因的影响

2.4 MT 对BPA 暴露的猪卵丘细胞扩展基因的影响

卵母细胞体外成熟培养44 h后收集卵丘细胞扩展相关基因Ptgs1、Ptgs2、Has2、 Tnfaip6。由图5可见，MT+BPA组Ptgs1的基因表达量与对照组相比无明显差异（P＞0.05），都显著高于BPA组（P＜0.05）。与对照组相比，BPA+MT组的Ptgs2的基因表达量显著升高（P＜0.05），BPA组Ptgs2的基因表达量与对照组相比显著降低（P＜0.05）。BPA+MT组Has2的基因表达量与对照组相比显著降低（P＜0.05），但仍显著高于BPA组（P＜0.05）。BPA+MT组Tnfaip6的基因表达量显著高于B PA 组（P＜0.05），但与对照组相比无明显差异（P＞0.05）。

图5 MT 对BPA 暴露的猪卵丘细胞扩展基因的影响

2.5 MT 对BPA 暴露的猪卵丘细胞连接基因的影响

卵母细胞体外成熟培养44 h后收集卵丘细胞连接相关基因Cx43、Cx45。由图6可见，MT+BPA组的Cx43基因表达量显著低于对照组（P＜0.05），但仍显著高于BPA组（P＜0.05）。与对照组相比，BPA组的Cx45基因表达量显著降低（P＜0.05），MT+BPA组的Cx45基因表达量显著高于对照组（P＜0.05）。

图6 MT 对猪卵丘细胞在BPA中暴露后连接基因的影响

3 讨论

卵丘细胞在卵母细胞体外成熟过程中起着关键作用。卵丘细胞介导卵泡微环境和母体特征来支持卵母细胞的生长、发育和获能。以往的研究表明，人类裸卵细胞在体外成熟发育过程中，在减数分裂复苏和减数分裂进行的过程中，维持中期特征的细胞质能力不足，减数分裂中断后倾向于自发激活，核成熟和细胞质成熟之间缺乏协调。此外，在一项对裸牛卵母细胞的研究中，发现卵裂率也降低。IVM过程中卵丘细胞的缺失也会影响卵母细胞的脂质代谢，导致胞质成熟不够理想，从而降低其发育能力。在本研究中，检测了卵丘细胞的扩展情况。结果表明，BPA组的卵丘细胞扩展指数与对照组相比显著降低，添加完M T 卵丘扩展指数显著升高，但仍低于对照组。其中对照组的COCs被卵丘多层包裹切扩散体积较大，BPA组的COCs扩散体积明显变小，卵丘细胞包裹层数少。说明BPA影响了卵丘细胞的扩展，添加10-7M的MT可以促进BPA暴露后的卵丘细胞扩展但无法完全消除损伤。

即使在极低的暴露水平下，BPA似乎也会干扰女性和男性的生殖功能。尽管BPA损害内分泌功能的途径多种多样，但氧化应激的改变仍然是男性和女性不育的关键因素。当ROS的产生超过其内源性抗氧化防御机制的保护能力时，就会发生氧化应激。ROS活性高会导致细胞损伤，但可通过氧化生物大分子和细胞器来稳定。SOD1作为超氧化物歧化酶，可以催化超氧阴离子自由基歧化为H2O2和O2，CAT将H2O2分解为氧气和水，可以通过中和自由基来保护机体免受ROS的侵袭。在本研究中，BPA暴露显著降低卵母细胞内CAT基因的表达量，SOD1基因表达量显著升高。添加MT后，CAT基因表达量显著升高但仍显著低于对照组。我们研究得出，BPA暴露后卵丘细胞的抗氧化能力降低，添加MT后抗氧化能力显著上升。

为了确定BPA暴露后卵丘细胞凋亡因子的变化，我们检测了卵丘细胞中抗调亡基因Bcl-2以及促调亡基因Bax的表达。结果表明，BPA暴露降低了抗调亡基因Bcl-2的mRNA表达，而显著提高了促调亡基因Bax的mRNA表达，在加入MT后，抗调亡基因Bcl-2的mRNA表达显著上升，回到对照组水平，促调亡基因Bax的mRNA表达量与对照组相比显著降低。BPA组的Bcl-2/Bax比例显著降低，BPA+MT组的Bcl-2/Bax比例显著升高，结果表明，BPA能促进卵丘凋亡，而MT通过抑制卵丘凋亡来保护卵丘细胞的发育。

以往的研究表明，卵丘细胞的扩展与细胞外基质（ECM）的产生有关，Has2合成的透明质酸包含基质的主要结构骨架，Tnfaip6也是ECM的重要组成部分。卵母细胞和卵丘细胞之间的相互作用是双向沟通的必要条件，卵母细胞与卵丘细胞之间的通信是通过缝隙连接进行的，缝隙连接也参与卵母细胞和卵丘细胞之间的分子转移。

在本研究中，检测了卵丘细胞扩展相关基因，发现BPA暴露后卵丘扩展基因Ptgs1、Ptgs2、Tnfaip6、Has2的基因表达水平显著降低；MT+BPA组Ptgs2基因的表达水平显著升高，同时显著高于对照组；显著升高了Ptgs1、Tnfaip6基因表达水平，与对照组相比差异不显著；Has2基因表达水平显著升高，但仍显著低于对照组。检测卵丘连接相关基因，发现BPA暴露后显著降低卵丘连接基因Cx43和Cx45的转录水平；添加MT的BPA组，Cx43基因转录水平显著升高，与对照组差异不显著；Cx45基因的转录水平显著升高，同时显著高于对照组；结果表明，卵丘细胞连接和扩展的基因表达在BPA暴露后受到了抑制，导致卵母细胞的成熟与发育能力下降。而添加MT后卵丘细胞连接和扩展的基因表达上调，表明MT并不仅是通过减缓 BPA对卵丘细胞的损伤来促进卵丘的连接和扩展，而是其本身对卵丘细胞连接和扩展有促进作用。

4 结论

本研究表明，在BPA染毒猪卵丘细胞体外成熟的过程中，MT不仅提高了卵丘扩展基因和卵丘连接基因的表达从而提高卵丘扩展指数，还提高了卵丘抗氧化基因和抗凋亡基因的表达，缓解了细胞的氧化应激和调亡，起到保护卵丘细胞的作用。