基于顶空-气相色谱-四极杆/飞行时间质谱及相对气味活度值分析潮汕橄榄菜风味物质组成

王健霞，刘袆帆，徐玉娟*，马路凯，3*，肖更生

（1.农业农村部岭南特色食品绿色加工与智能制造重点试验室，仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510631；2.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东 广州 510610；3.西藏自治区农牧科学院 农产品开发与食品科学研究所，西藏 拉萨 850000）

橄榄菜（olive vegetable）是以橄榄果和芥菜为原料，经腌制得到有特殊鲜味和香味的酱菜[1]，富含多种营养成分、维生素及人体必需的钙、碘、铁锌等元素，是岭南潮汕地区特色代表性产品之一，其因特殊风味深受消费者喜爱。根据SB/T 10297—1999《酱腌菜分类》，橄榄菜属于酱腌菜，酱腌菜原料的来源、用量、腌渍时间、温度等均有严格要求。2007 年商务部颁布了SB/T 10439—2007《酱腌菜》，对酱腌菜制定了商业标准。

腌制蔬菜香味成分丰富，其风味的优劣不仅关乎其品质，还会直接影响其消费市场。目前的研究主要集中在泡菜、酸菜、雪菜、大头菜等酱腌菜的风味方面，Xiao 等[2]采用气质联用仪（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）对江西腌菜、四川泡菜、东北酸菜挥发性化合物进行探究，得出四川泡菜的主要风味化合物为异普勒醇和芳樟醇，江西腌菜中的主要挥发性化合物是二甲基二硫化物、2，4-二甲基噻唑、4-乙基-5-甲基噻唑和3-甲基-1，2-噻唑，在东北酸菜中，壬酸乙酯、2-甲基戊酸乙酯和二硫化二甲酯为主要挥发性化合物。Zhang 等[3]采用GC-MS 对雪菜中的挥发性物质进行探究得出，异硫氰酸烯丙基酯、乙酸乙酯、3-丁腈、苯酚、乙醇和3-（2，6，6-三甲基-1-环己烯-1-基）丙烯醛是雪菜传统和现代发酵的主要风味化合物；Luo 等[4]采用GC-MS 对小姜泡菜的挥发性化合物进行分析，发现小姜泡菜中相对含量最高的香气成分是醋酸香叶酯；张钰麟等[5]采用GC-MS 对不同温度腌制大头菜的风味物质进行研究，并结合相对气味活度值（relative odor activity values，ROAV）法对主要风味物质进行鉴定，结果表明大头菜在低温腌制下的风味物质主要是醇类、酯类、烯类和腈类，其中1-辛烯-3 醇、苯乙醇、2-苯基乙基异硫代氰酸酯、桉叶油醇、苯代丙腈为特征性的风味物质。Yun 等[6]采用GC-MS 对四川、重庆商业泡菜和接种泡菜挥发性化合物进行探究，发现乙酸香叶酯、二甲基三硫醚、桉叶油醇和芳樟醇是影响自然发酵泡菜风味特征的主要化合物，二甲基三硫化物，二甲基二硫化物是接种泡菜的气味贡献者。以上研究均表明传统酱菜风味物质组成较为复杂，且受加工工艺影响，对酱菜风味解析可有效保证其品质。目前对橄榄菜风味的研究较少，关于潮汕地区特色酱菜橄榄菜的风味物质组成，以及其关键的风味物质尚缺乏系统研究。

气相色谱-四极杆/飞行时间质谱（gas chromatography-quadrupole-time of flight-mass spectrometry，GCQTOF/MS）分辨率高，灵敏性好，并且以图谱进行检索能够推测化合物的裂解规律，比单纯的串联质谱结果更加准确可靠，可以通过化合物的裂解规律进行结构鉴定。本研究通过顶空-气相色谱-四极杆/飞行时间质谱结合ROVA 法及感官评价，对潮汕橄榄菜的风味物质组成进行定性分析，并对其关键风味物质进行解析，以期为潮汕橄榄菜的品质分析提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

橄榄菜：广东蓬盛味业有限公司。

氢氧化钠（分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；盐酸、无水乙醚（均为分析纯）：广东广试试剂科技有限公司；乙醇（分析纯）、石油醚（分析纯，沸程30～60 ℃）、乙腈（色谱纯）：天津市富宇精细化工有限供公司；碘、碘化钾、乙酸锌、亚铁氰化钾、硝酸银、铬酸钾（均为分析纯）：天津市福晨化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

7697-7890B-7200 顶空-气相色谱-四极杆/飞行时间质谱仪、DB-624 色谱柱（30 m×250 μm，1.4 μm）：美国Agilent 公司；BSA423S-CW 电子天平（感量1 mg）：德国赛多利斯公司；HWS-24 电热恒温水浴锅、BPG-9156A 鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；DL-400B 智能超声波清洗器：上海之信仪器有限公司；DF-101S 磁力搅拌器：上海力辰邦西仪器科技有限公司；JB-1042 低速离心机：安徽嘉文仪器装备有限公司；CBM-20A 高效液相色谱仪：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

将同一批次的橄榄菜混匀，-80 ℃储藏，待测。

1.3.2 理化指标测定

参考GB 5009.3—2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》第一法测定样品的水分含量；参考GB 5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》第二法测定样品的脂肪含量；参照GB 5009.8—2016《食品安全国家标准食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的测定》第一法测定样品的糖分含量；参照GB 5009.42—2016《食品安全国家标准食盐指标的测定》第一法测定样品的食盐含量。

1.3.3 定性分析

1.3.3.1 样品前处理

精密称取橄榄菜样品5.0 g，置于20 mL 顶空瓶中，密封后置于样品盘上。根据顶空进样条件（样品瓶加热温度120 ℃，定量环温度130 ℃，传输线温度140 ℃，平衡时间30 min）进行分析。

1.3.3.2 GC-QTOF/MS 条件

GC 条件：DB-624 色谱柱（30 m×250 μm，1.4 μm）；载气为氦气；传输线温度280 ℃。进样量1 μL，进样口260 ℃，分流进样，分流比20∶1，流速1.2 mL/min；色谱柱初始温度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min 升温到120 ℃，然后以15 ℃/min 升温到260 ℃保持5 min。

QTOF/MS 条件：扫描方式为Scan 模式，扫描范围m/z 35～800，采集频率500 ms；电离方式为电子轰击离子源（electron ionization，EI），电子能量70 eV；离子源温度230 ℃。

1.3.4 定量分析

采用DB-624 色谱柱（30 m×250 μm，1.4 μm），通过NIST 14 数据库进行化合物检索并鉴别，以组分面积为依据，采用面积归一化方法进行定量分析。

1.3.5 关键风味物质的评价

参照Zhu 等[7]的方法，根据ROAV 值来确定关键挥发性物质对橄榄菜风味的影响，样品风味贡献程度最大的物质的ROAV 为100，样品中其他风味物质的ROAV（W）可通过下列公式计算。

式中：Ca、Cmax分别为不同挥发性成分的相对含量和样品风味贡献程度最大的挥发性物质相对含量，%；Tmax、Ta分别为对样品风味贡献程度最大的挥发性物质感官阈值和各挥发性成分的感官阈值，mg/kg。

对于所有的风味物质，0≤ROAV≤100。0.1≤ROAV<1，说明对样品的风味起修饰作用；ROAV≥1 时，说明这种物质为样品的关键风味物质，ROAV 越大，则说明该挥发性物质对样品风味贡献越大。

1.3.6 感官评价

挑选10 名食品专业人员（男女各半）组成感官评价小组，分别从滋味、气味、色泽和质地4 个方面对橄榄菜进行评分（10 分制）。感官评价标准如表1 所示。

表1 感官评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria

1.4 数据处理

每个试验3 次，结果为平均值±标准差，采用Excel 2010 分析试验数据平均值和标准差，运用Origin 2019 作图。

2 结果与分析

2.1 橄榄菜中理化指标结果

橄榄菜中的成分较为复杂，通过对其水分、食盐、脂肪、糖分检测，结果显示每100 g 橄榄菜中含水分（2.33±0.05）g、食盐（3.10±0.08）%、脂肪（45.40±0.29）g、糖分（0.17±0.02）g。根据SB/T 10297—1999《酱腌菜的分类》可知橄榄菜属酱油渍菜类，橄榄菜样品中的水分和食盐含量均符合SB/T 10439—2007《酱腌菜》规定的理化指标。糖分的含量较少可能原因是蔬菜本身含有的糖分经过加工而析出。橄榄菜中的脂肪含量很大，据相关文献报道食用植物油含有多种挥发性物质对食品的风味的影响也很大，油脂是橄榄菜的主要风味物质之一[8]。

2.2 橄榄菜挥发性成分组成

橄榄菜因其特殊的香气，增加消费者的食欲。对橄榄菜的挥发性物质组成进行分析，结果如表2 所示。进一步可视化分析结果如图1 所示。

图1 橄榄菜挥发性物质种类三维扇形图（匹配因子≥80%）Fig.1 Three-dimensional fan chart of volatile substances of olive vegetable（matching factor≥80%）

由表2 可知，橄榄菜中共检出匹配度大于80%的挥发性风味物质44 种，其中醇类物质6 种、烷类物质6 种、醛类物质4 种、酯类物质4 种、酸类物质3 种、酮类物质2 种、杂环类物质7 种，硫化物4 种，其他物质8 种。

橄榄菜众多的挥发性物质中，醇类物质（28.06%）含量最高，其次是醛类（23.34%）和酸类（15.24%）物质。在醇类物质中环丙基甲基甲醇（26.93%）含量最高，在醛类物质中，丙醛（23.07%）的含量最高，在酸类物质中乙酸（14.99%）的含量最高。由此可判断橄榄菜中主要的挥发性物质成分为环丙基甲基甲醇、丙醛（腥味、青草味）、乙酸（酸香）。

橄榄菜中醇类物质中环丙基甲基甲醇含量较多，占比26.93%。其主要是由于溴甲烷经过一系列的反应生成二溴甲烷，二溴甲烷与丁烯酮经过化学反应产生大量的环丙基甲基甲醇。橄榄菜在发酵过程中含有大量微生物，据相关报道，芥菜在发酵过程中醇类物质的增加除了与微生物的次生代谢物有关，还可能是由酯化、氧化和微生物在芥菜叶发酵过程中产生的次生代谢物引起[18]。

经研究发现，橄榄菜中醛类物质产生与脂肪氧化有关，不饱和脂类氧化产生的醛类物质是油脂分为的主要来源，且主要为己醛和丙醛，橄榄菜中油脂含量丰富，油脂经过脂肪氧化产生多种醛类物质，例如亚麻酸经过氧化生成丙醛，呈现出腥味和青草味[15]。此外，蔬菜在加工过程中细胞发生破损，醛类物质得以释放；发酵过程中也会生成醛类等新的挥发性物质[19]。

橄榄菜中酸类物质中乙酸含量较高，占比14.99%。这是与橄榄菜加工过程所使用的油脂中所含有的酸类呈香物质较多有关，Ivanova-Petropulos 等[20]研究发现，菜籽油、葵花籽油、芝麻油、南瓜籽油中含有大量的乙酸。与本文结果一致。

杂环类化合物也是一类重要的香气成分，橄榄菜中也含有少量的该类物质，包括吡嗪类和呋喃类物质。这两类物质主要与非酶促的美拉德反应有关。其中吡嗪类物质是由两个具有α-氨基羰基结构的化合物经缩合反应，在生成二氢吡嗪后发生自动氧化而产生，在较低浓度下呈现烤坚果香味[21]；呋喃类物质经过脂质过氧化、碳水化合物降解和美拉德反应形成。例如，2-戊基呋喃在橄榄油、亚麻籽油、核桃油、葵花籽油和菜籽油等多种植物油中被检测出[22]。该物质通过亚油酸中的9-羟基自由基与氧气反应生成过氧化氢乙烯基，通过烷氧基环化反应使含有这类物质的食品呈现出浓郁的香甜味。

2.3 关键风味物质的ROAV 分析

通过查阅《化合物香味阈值汇编》[23]得到橄榄菜挥发性风味物质的感官阈值，橄榄菜每种挥发性风味物质ROAV 见表3。

表3 橄榄菜挥发性物质相对气味活度值Table 3 Relative odor activity value（ROAV）of volatile substances in olive vegetable

由表3 可知，乙硫醇（ROAV 为100）对其风味的贡献值最大。ROAV≥1 的关键挥发性物质成分为乙硫醇、甲硫醇，0.1≤ROAV<1 的挥发性物质为正丙醛，对橄榄菜风味起修饰作用。

乙硫醇和甲硫醇是由橄榄菜中含有硫化物经过发酵反应生成；通过表2 可知，橄榄菜中含有氧硫化碳、二硫化碳、二甲基三硫等挥发性成分，氧硫化碳遇橄榄菜中的水分后，可生成具有洋葱、橡胶的味道的乙硫醇，乙硫醇在水中的阈值较低，对风味贡献较大，因此赋予橄榄菜特殊风味。而二硫化碳和二甲基三硫经过一系列的化学反应会生成具有熏菜味的甲硫醇。有研究发现萝卜泡菜的特征风味物质也是二甲基三硫，且芳樟醇、辛酸乙酯等香气物质对萝卜泡菜的香气喜好度和整体喜好度贡献较大[24]，与本文结果相似。李从聪[25]在探究腌制油菜苔风味特征中也发现二甲基三硫是腌制油菜苔的关键风味物质。橄榄菜中的成分复杂，因二甲基三硫转化成甲硫醇的阈值比其自身的阈值更低，因而对橄榄菜的风味贡献较大。

对橄榄菜风味起修饰作用的丙醛除了因脂肪氧化和美拉德反应产生外，还可能是橄榄菜中添加的大蒜等物质，在加工过程中受到破坏，异蒜氨与酶相互反应生成的硫代醋酸S-甲酯在与蒜氨酸酶和催泪因子合成酶相互反应生成丙醛[26]。橄榄菜中脂肪含有一定量的油脂，油脂中的不饱和脂肪酸（亚油酸和n-3 型脂肪酸）发生氧化分解，生成一定量的丙醛[27]。

2.4 感官评价结果

橄榄菜感官评价结果如表4 所示。

从表4 中可以看出，新制作出的橄榄菜色泽乌艳诱人，质地均匀细腻，油香浓郁，鲜咸可口。由于制作出来的橄榄菜中油脂的气味、配料的香味的结合使橄榄菜呈现出这样的特点。

橄榄菜感官评价雷达图见图2。

图2 橄榄菜感官评价雷达图Fig.2 Sensory evaluation radar map of olive vegetable

由图2 可知，在橄榄菜感官评价中，橄榄菜整体评分较高，滋味、气味、色泽、质地较好，深受评价人员喜爱。结合表4 可以看出，色泽和质地评价高于滋味和气味，这表明新制作的橄榄菜客观状态得到消费者的认可，橄榄菜中油脂、配料、及橄榄菜本身会发出的香气及制作手法因每个人的喜爱程度不同而产生差异。

3 结论

本研究采用HS-GC-QTOF/MS 对潮汕橄榄菜风味物质的组成进行探究，结合ROAV 法对橄榄菜的关键风味物质进行分析，发现橄榄菜中共检出酸类、醇类、烷类、醛类、酯类等挥发性风味物质44 种（匹配度大于80%），其中醇类物质6 种、烷类物质6 种、醛类物质4 种、酯类物质4 种、酸类物质3 种、酮类物质2 种、杂环类物质7 种，硫化物4 种，其他物质8 种。主要挥发性物质为环丙基甲基甲醇、丙醛、乙酸，其关键风味物质（ROAV≥0.1）为乙硫醇、甲硫醇、丙醛。本研究为橄榄菜主要挥发性物质分析提供了理论依据，为潮汕橄榄菜产业的发展提供了一定的理论支撑。