基于QbD理念的散偏汤提取工艺设计空间预测△

孙萌，刘雪纯，赵玥瑛，张晴，席铖，董爽，张馨雨，杜守颖，白洁，陆洋

北京中医药大学 中药学院，北京 102488

散偏汤出自清代《辨证录》[1]，主治偏头痛。现代研究表明，其对血管神经型偏头痛、急性缺血性卒中、抑郁症等疾病具有显著疗效[2-5]。本课题组前期对散偏汤的基准样品质量标准进行了研究[6]，本研究在基准样品的基础上进一步研究其颗粒剂的提取工艺。

质量源于设计（QbD）理念在21 世纪初由美国食品药品监督管理局（FDA）最初应用到药品质量控制领域，国际人用药品注册技术协调会（ICH）发布的质量指导原则Q8（R2）：药品研发/问答[Q8（R2）: Pharmaceutical Development][7]将QbD 定义为一种系统化的开发方法，即以预定义的产品质量目标作为设计起始，以合理的科学实验和质量风险管理为基础，深入理解产品属性和过程控制，其对于中药制剂生产过程中的质量控制有一定指导意义。2010 年发布的《关于加快医药行业结构调整的指导意见》[8]阐明要促进现代科学技术全过程应用于中药生产，革新中药制剂从提取分离到生产的全过程质量控制技术，而QbD 理念的核心恰恰在于过程质量控制。在QbD 理念的基础上，徐冰等[9]提出中药制剂生产过程中设计空间（DS）的应用策略。中药制剂实际生产过程存在一定的局限性：首先，实验室生产环境下生产规模小，各项工艺参数能做到精准控制，而企业中试放大生产难以高度还原实验室小试中的各项工艺参数，无法保证产品的质量均一性，而DS的建立能够在合理范围内实现弹性化过程质量控制，更适于工业生产；其次，一个合理的DS应当能够保证空间内工艺参数的调整均不会引起质量的异常，因此参数调整更加灵活，可以根据不同产地、不同批次物料的质量特性灵活变化，使最终的产品质量属性趋向一致；最后，DS内的操作均不视为工艺变更，中药制剂工艺参数的微调无需再次申报，能更好地节省人力、物力，节约资源。

QbD 理念的具体思路是研究产品的关键质量属性（CQAs），确定制剂的关键工艺参数（CPPs），借助数学模型建立联系，保留具备容错弹性的DS，以产品CQAs 为决策变量倒推生产过程前端各工艺单元参数，建立药品生产过程质量控制。CPPs 与CQAs 之间关联拟合模型的建立有多种方法，其中Box-Behnken 设计响应面法因其全面性及操作简便性被广泛使用，其能够建立参数与工艺水平之间的函数关系，进而针对目标工艺水平进行工艺参数的预测和优化[10-13]。

本研究以散偏汤为例，基于QbD 理念，采用Box-Behnken 设计响应面法拟合CPPs 与CQAs 数学模型，探究其多维交互作用，基于《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则（试行）》要求建立散偏汤提取工艺的DS[14]，以寻求适配工业生产的散偏汤提取工艺的CPPs。

1 材料

1.1 仪器

BSA224S 型电子分析天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；H22-X3 型九阳电陶炉（杭州九阳生活电器有限公司）；HH-6 型电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器有限公司）；DZF-6051 型真空干燥器（北京利康达圣科技有限公司）；DZ47SD20 型真空冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；LC-20A 型高效液相色谱仪[岛津（中国）有限公司]；UItimate 3000型高效液相色谱仪[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]。

1.2 试药

对照品阿魏酸（批号：110773-201915，纯度：99.0%）、芥子碱硫氰酸盐（批号：111702-202006，纯度：98.3%）、甘草苷（批号：111610-201908，纯度：93.1%）、甘草酸铵（批号：110731-202021，纯度：97.7%）均购于中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇、磷酸均为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

川芎（四川眉山，批号：2009072）、白芍（安徽亳州，批号：200623）、白芥子（四川南充，批号：200213）、甘草（甘肃武威，批号：201804-3）、柴胡（甘肃康乐，批号：TS-4）、郁李仁（甘肃天水，批号：160944）、白芷（四川遂宁，批号：201801-4）、香附（河南开封，批号：2009080）均购自亿帆医药股份有限公司，经北京中医药大学刘春生教授鉴定分别为伞形科植物川芎Ligusticum chuanxiongHort.的干燥根茎、毛茛科植物芍药Paeonia lactifloraPall.的干燥根、十字花科植物白芥Sinapis albaL.的干燥成熟种子、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根茎、伞形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.的干燥根、蔷薇科植物郁李Prunus japonicaThunb.的干燥成熟种子、伞形科植物杭白芷Angelica dahurica(Fisch.ex Hoffm.) Benth.et Hook.f.var.formosana(Boiss.)Shan et Yuan 的干燥根、莎草科植物莎草Cyperus rotundusL.的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 CPPs的建立

采用鱼骨图作为风险辨识工具，按照“机、环、人、料、法”梳理挖掘质量风险相关工艺参数，初步确定潜在的CPPs。

通过鱼骨图（图1）工具将生产工艺中的风险相关工艺步骤梳理完毕，初步划定潜在的关键工艺，通过失效模式与效应分析（FMEA），将所涉及的多种因素进行风险顺序级数（RPN）的评估[15]。以前期研究经验及工业基础知识为依据，评估工艺参数中失效项目发生的频率（P）、严重程度（S）和检测等级（N）。P是指该失效原因在生产过程中的发生频率，其数值越大，发生失效项目的频率越高；S用于评估失效项目发生对于整个工艺水平的影响程度，其数值越大，代表其对工艺水平影响越大；N用于评估失效项目能够被检测出来的难易程度，其数值越大，该项目越难被检测到。每个因数的取值范围设定为1～10。

图1 散偏汤提取工艺参数风险辨识鱼骨图

人员因素、设备因素和环境因素引起产品质量失效发生的频率均较低，故P为2～4，而工艺因素和物料因素引起产品质量失效频率更高，P为7～8，且物料因素高于工艺因素；人员因素、设备因素及环境因素引起产品质量失效的严重性不高，S为3～4，但工艺参数的改变可能导致提取效率的改变，不同产地、不同批次药材的成分组成和含量差异可能很大，因此工艺因素和物料因素对产品质量的影响更严重，S为5～8；设备因素、物料因素和环境因素均处于可控范围内，故其N较低，为2～3，人员因素和工艺因素相对更不稳定，因此N较高。按公式（1）计算RPN。

RPN<50 记为低优先级，50≤RPN<125 为中优先级，RPN≥125 为高优先级，结果见表1。人员因素、设备因素和环境因素的RPN 均处于低优先级，物料因素的RPN 处于中优先级，而工艺因素的RPN 处于高优先级。对高优先级因素进行考察，选择提取次数、提取时间、加水倍量作为散偏汤提取工艺的CPPs，中、低优先级因素暂设为常量。

表1 散偏汤提取工艺的CPPs的RPN评估

2.2 CQAs的建立及指标检测

依据前期确定的基准样品标准[6]选取阿魏酸、芥子碱硫氰酸盐、甘草苷和甘草酸含量及出膏率为CQAs。

2.2.1 基准样品制备 按处方量称取饮片共90 g，加入7 倍量去离子水（630 mL），浸泡0.5 h，煎煮45 min，经过300 目尼龙布滤过；滤渣继续加水540 mL，煎煮35 min，滤过，合并滤液，放冷至室温后调整体积至600 mL。

移取水煎液200 mL 到蒸发皿中，水浴加热，将水煎液浓缩到稠膏状态，60 °C 真空干燥72 h，按公式（2）计算出膏率。

取前述水煎液10 mL，–20 ℃放置12 h 至完全固态，低于10 Pa 真空度下–80 ℃冻干72 h，压盖密封，即为散偏汤基准样品。

2.2.2 色谱条件

2.2.2.1 阿魏酸及芥子碱硫氰酸盐的含量测定 Waters Xselect ® HSS T3 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B）为流动相梯度洗脱（0～10 min，2%A；10～18 min，2%～6%A；18～45 min，6%～10%A；45～90 min，10%～15%A；90～110 min，15%～95%A）；柱温为30 ℃；流速为1 mL·min–1；进样量为10 μL；波长为321 nm。

2.2.2.2 甘草苷及甘草酸的含量测定 资生堂CAPCELL PAK C18MGS5 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B）为流动相梯度洗脱（0～8 min，19%～20%A；8～20 min，20%～33%A；20～40 min，33%～50%A；40～45 min，50%～100%A；45～49 min，100%～19%A）；柱温为30 ℃；流速为1 mL·min–1；进样量为10 μL；波长为237 nm[6]。

2.2.3 供试品溶液制备

2.2.3.1 基准样品供试品溶液制备 取2.2.1 项下冻干粉，去离子水复溶，超声（250 W，40 kHz）处理30 min，使得其快速溶解完全，置10 mL 量瓶，加入去离子水定容，10 000 r·min–1下离心10 min（离心半径为5.79 cm），采用0.45 μm 针式滤器滤过，即得。

2.2.3.2 提取液供试品溶液制备 取处方量饮片加水浸泡30 min，回流，滤过，放冷至室温后调整滤液体积一致，10 000 r·min–1下离心10 min（离心半径为5.79 cm），采用0.45 μm针式滤器滤过，即得。

2.2.4 对照品溶液制备 分别精密称取阿魏酸对照品9.50 mg、芥子碱硫氰酸盐对照品9.85 mg于10 mL量瓶中，70%甲醇定容，得质量浓度为940.50 μg·mL–1的阿魏酸对照品母液，以70%甲醇稀释20 倍；得到质量浓度为968.26 μg·mL–1的芥子碱硫氰酸盐对照品母液，以70%甲醇稀释10倍。

分别精密称取甘草苷对照品9.69 mg、甘草酸铵对照品10.05 mg 于10 mL 量瓶中，70%乙醇定容，得质量浓度分别为902.14、1 002.21 μg·mL–1的甘草苷、甘草酸对照品母液，以70%乙醇稀释10倍。

2.2.5 出膏率测定 将提取液转移至蒸发皿中浓缩至适当体积后，水浴加热浓缩为稠膏，60 ℃减压干燥72 h，按公式（2）计算出膏率。

2.3 DS的建立

2.3.1 单因素考察 分别考察加水倍量和提取时间两因素各水平下指标成分含量及出膏率，结果见图2、图3，依据单因素试验结果，选择5 倍加水量为低水平，20倍加水量为高水平。

图2 不同加水倍量散偏汤各指标成分质量分数及出膏率（±s,n=2）

图3 不同提取时间散偏汤各指标成分质量分数及出膏率（±s,n=2）

由图3 可知，4 个指标性成分含量随提取时间延长变化较小，其中阿魏酸含量与提取时间呈正相关，其他3 个指标性成分含量均在90 min 时达到最高。阿魏酸在浓缩、干燥过程中损失率最大，甘草酸损失率最小，考虑损失率的原因，故虽然甘草酸在150 min含量最低，但为了综合保证提取液中各指标性成分的含量，仍选择60 min为低水平，150 min为高水平。

2.3.2 Box-Behnken 响应面法 结合前期试验，以CPPs 为考察因素，以CQAs[Y1（阿魏酸含量）、Y2（芥子碱硫氰酸盐含量）、Y3（甘草苷含量）、Y4（甘草酸含量）、Y5（出膏率）]为评价指标，进行Box-Behnken 响应面单因素试验设计，每一影响因素设置3个考察水平，见表2。

表2 散偏汤提取工艺Box-Behnken响应面试验设计因素水平

2.3.3 结果 根据Design Expert 10.0 软件设计的试验顺序进行各组试验，每组试验所得CQAs 结果见表3。

表3 散偏汤提取工艺Box-Behnken响应面试验结果

2.3.4 模型拟合及DS 建立 采用Design Expert 10.0 软件内设程序对Y1～Y5进行拟合，得回归方程：Y1=0.661 6–0.000 1A+0.094 8B+0.105 6C+0.044 5AB–0.030 7AC–0.040 0BC–0.035 4A²–0.055 7B²–0.041 4C²；Y2=0.969 2–0.009 0A+0.086 0B+0.108 3C+0.015 2AB– 0.009 8AC–0.101 8BC+0.044 5A²–0.085 0B²–0.072 5C²；Y3=0.368 2+0.007 1A+0.084 8B+0.099 1C；Y4=0.614 4+0.055 3A+0.153 0B+0.287 0C+0.075 5AB +0.072 5AC+0.010 0BC ；Y5=28.780 0+0.785 0A+2.280 0B+3.770 0C。ANOVA方差分析结果见表4。

表4 散偏汤提取工艺的CPPs对CQAs拟合模型的ANOVA方差分析

方差结果显示，阿魏酸、芥子碱硫氰酸盐、甘草酸含量及出膏率的拟合模型方差显著，除阿魏酸外其他拟合模型失拟项不显著，表明模型基本可靠。上述函数拟合的r超过80%，表明其能够较可靠地说明大部分指标变化与考察因素之间的关系。调整决定系数（R2

adj）超过77%，说明模型回归拟合度高，基本符合拟合方程。另外，甘草苷的拟合模型方差不显著，失拟项也不显著，说明该模型拟合程度较差。

分析结果发现，3 个考察因素对阿魏酸、芥子碱硫氰酸盐、甘草酸含量的影响均存在交互作用，其响应面及等高线图见图4～图6。

图4 提取时间、加水倍量和提取次数对阿魏酸质量分数影响的交互作用

图4 等高线在加水倍量方向上变化较为密集，而在提取时间方向上变化较为疏松，说明加水倍量更能够影响阿魏酸含量变化，提取时间因素则次之；在提取次数方向上变化较为密集，而在提取时间方向上变化较为疏松，说明提取次数更能够影响阿魏酸含量变化，提取时间因素则次之；在两个方向上的疏密变化基本无差别，说明加水倍量对阿魏酸含量变化的影响与提取次数相近。综上认为，按各因素对阿魏酸含量变化的影响程度从高至低为提取次数、加水倍量、提取时间。

图5 等高线在加水倍量方向上变化较为密集，而在提取时间方向上变化较为疏松，说明加水倍量更能够影响芥子碱硫氰酸盐含量变化，提取时间因素则次之；在提取次数方向上变化较为密集，而在提取时间方向上变化较为疏松，说明提取次数更能够影响芥子碱硫氰酸盐含量变化，提取时间因素则次之；在加水倍量方向及提取次数两方向上变化疏密程度相近，说明加水倍量与提取次数两因素对芥子碱硫氰酸盐含量变化的影响程度相近。综上认为，按各因素对芥子碱硫氰酸盐含量变化的影响程度从高至低为加水倍量、提取次数、提取时间。

图5 提取时间、加水倍量和提取次数对芥子碱硫氰酸盐质量分数影响的交互作用

图6等高线在加水倍量方向上变化较为密集，而在提取时间方向上变化较为疏松，说明加水倍量更能够影响甘草酸含量变化，提取时间因素则次之；在提取次数方向上变化较为密集，而在提取时间方向上变化较为疏松，说明提取次数更能够影响甘草酸含量变化，提取时间因素则次之；在提取次数方向上变化较为密集，而在加水倍量方向上变化较为疏松，说明提取次数更能够影响甘草酸含量变化，加水倍量因素则次之。综上认为，按各因素对甘草酸含量变化的影响程度从高至低为提取次数、加水倍量、提取时间。

图6 提取时间、加水倍量和提取次数对甘草酸质量分数影响的交互作用

由图4～图6 推测提取时间与提取次数、加水倍量与提取次数产生更强的交互，对3 个成分含量影响较大。

本课题组前期研究数据显示，提取-浓缩-干燥过程中阿魏酸损失率约为40%，芥子碱硫氰酸盐损失率约为25%，甘草苷损失率约为20%，甘草酸损失率约为5%。依据本课题组已有的研究基础，首先建立15 批散偏汤物质基准的指标成分含量标准范围[6]，考虑到企业实际生产中可能出现的损失率过大的情况，故将各指标最小值设定为基准样品中指标成分含量的平均值，最大值设定为基准样品中的指标成分含量平均值×（损失率+1.3），则CQAs 的目标为Y1：0.303‰～0.515‰、Y2：0.603‰～0.935‰、Y3：0.233‰～0.349‰、Y4：0.336‰～0.454‰、Y5：23.72%～30.84%。以此目标范围为条件，搜索符合目标的工艺参数范围，将5 个单指标的DS 取交集，构建多指标综合DS，采用Design Expert 10.0 内设程序进行Overlay Plot直观化，结果见图7。

图7 不同提取次数下的散偏汤提取工艺DS

图7中黄色部分即为符合Y1、Y2、Y3、Y4、Y5指标范围要求的DS 的交集，通过Overlay Plot展示发现，进行3次提取时，无论考察因素如何变化，响应值均无法同时符合5个指标的范围要求；进行2次提取时DS较为狭窄，故选择提取1次，图7A中符合黄色部分范围的工艺参数交集即为散偏汤提取工艺DS，该DS内所有工艺点的试验结果均符合CQAs目标范围。

在所建立的DS 内选取一试验点进行工艺验证，验证结果见表5。结果显示，依照该试验点的工艺参数进行试验，得到每个处方中阿魏酸质量分数均值为0.450‰、芥子碱硫氰酸盐质量分数均值为0.787‰、甘草苷质量分数均值为0.248‰、甘草酸质量分数均值为0.451‰，出膏率均值为23.83%，所得结果均符合前述CQAs的目标范围。

表5 散偏汤提取工艺DS验证实验（±s,n=3）

表5 散偏汤提取工艺DS验证实验（±s,n=3）

注：提取时间为60 min；加水倍量为20倍。

3 讨论

经典名方以中医经典和临床经验为基础，是体现中医理论精华的重要载体，现代研究对中药复方的药效物质基础研究逐渐深入，认为其中的有效成分是复方起效的基础，而制剂工艺参数的优化又是控制成分含量的关键环节。传统的质量源于检验（QbT）理念是通过后端设限来控制质量，具有一定的局限性，没有从根本上解决药品质量均一性的问题，而基于QbD 理念的质量控制着眼于药品生产过程，将关键工艺单元的CPPs控制在合理范围内，同时对工艺参数变化设置一定的弹性DS，使得质量控制过程更加灵活。

本研究采用鱼骨图结合FMEA 确定提取工艺的CPPs，以提取液中4 个指标成分含量及出膏率为CQAs，通过Box-Behnken 响应面法试验拟合各指标的数学模型，建立DS，进行散偏汤提取工艺的预测和弹性优化，并验证了DS工艺的可行性。

本研究基于QbD 理念，依据《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则（试行）》的要求和实际生产中可能出现的情况建立了DS[14]，并在空间内取点验证，在考虑到成分损失率的基础上均满足前期建立的质量标准，表明该提取工艺可靠，后续实际生产中可根据企业人员、设备、环境及物料因素的变化对该DS 做出微调，进行DS的精准化、个性化划分，可为企业中试放大生产提供一定参考价值。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。