白木香内生真菌的分离鉴定及诱导结香作用研究△

黄颖，何欣，李浩凌，孟慧，陈旭玉，魏建和，陈德力，王斌，杨云*

1.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 中草药物质基础与资源利用教育部重点实验室/濒危药材繁育国家工程实验室，北京 100193；2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 海南分所 海南省南药资源保护与开发重点实验室/国家中医药管理局沉香可持续利用重点研究室，海南 海口 570311

白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg 又称土沉香、牙香树，是瑞香科（Thymelaeaceae）沉香属（Aquilaria）珍贵药用植物，主要分布于海南、广东、广西等地[1]。白木香是国产药用沉香的唯一基原植物，其木质部中所含黑色树脂称为沉香[2-3]。沉香具行气止痛、温中止呕、纳气平喘功效，现代药理学研究证明其具有镇痛、镇静、抗菌、抗炎、改善心肌缺血、抗肿瘤等作用[4]。白木香不会在自然状态下结香，只有树木受到自然损伤或人为伤害后，才会在伤口处累积树脂，经过数十年沉积才能形成沉香[5]。由于沉香资源再生困难且被过度开发，沉香属和拟沉香属的全部植物均被纳入《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）附录Ⅱ[6]。沉香稀有且价格高昂，在市场上长期处于供不应求的状态，故其结香技术被广泛关注。本课题组在2010 年发明了通体结香技术：通过植物自身的蒸腾作用将安全的结香液输送至植物各部位，促使整株白木香树内部结香[7]。该技术突破了白木香树规模化产沉香的技术瓶颈，但单株产量和品质有待进一步提升。

许多学者认为微生物在沉香形成过程中发挥着重要作用，已有文献报道内生真菌能够有效促进白木香结香。例如，Cui 等[8]证明野生沉香中分离出的Paraconiothyrium variabile可诱导白木香结香，结香品质与天然沉香相似；Chen 等[9]筛选出2株具有良好诱导效果的可可色二孢菌Lasiodiplodia theobromae，2 个月即可诱导白木香结香；Zhang等[10]发现，尖孢镰刀菌Fusarium oxysporum可快速诱导生成优质沉香。然而，实际生产中仍以物理方法（如砍伤等）和化学诱导法为主，真菌结香方式并未广泛应用。为了获得能够高效促进白木香产生优质沉香的菌株，本研究以经通体结香技术诱导的白木香为研究对象，对木质部结香部位附近的内生真菌进行分离和初步鉴定，并进一步研究这些真菌诱导白木香结香的效果，为应用真菌综合开发沉香资源提供参考。

1 材料

1.1 样品

白木香木质部样品于2022 年5 月采自中国医学科学院药用植物研究所海南分所海口研发中心试验田，样品来源于3 年生白木香树，经中国医学科学院药用植物研究所海南分所杨云研究员鉴定为白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg。凭证标本保存于中国医学科学院药用植物研究所海南分所海南省中药材标本馆。

1.2 仪器

SW-CJ-2D型超净工作台（上海沪净医疗器械有限公司）；GR60DA 型全自动立式高压灭菌锅[致微（厦门）仪器有限公司]；SPX-70B 型生化培养箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；ZWY-2012C 型立式双层恒温摇床（常州易晨仪器制造有限公司）；Z216MK 型台式小型高速冷冻离心机[贺默（上海）仪器科技有限公司]；ECLIPSE80i 型生物显微镜（日本尼康株式会社）；HH-6型电热恒温水浴锅（江苏科技仪器有限公司）；2695/2475 型高效液相色谱仪[沃特世科技（上海）有限公司]；AL104-IC 型电子天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]；SB25-12DTDN 型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；DHG-9070A 型恒温电热鼓风干燥箱（上海恒科学仪器有限公司）。

1.3 试药

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（批号：HB0233，青岛海博生物科技有限公司）；沉香四醇对照品（批号：111980-201904，纯度：98.6%）、沉香对照药材（批号：121222-201203）均购自中国食品药品检定研究院；真菌基因组DNA 提取试剂盒（美国Omega Biotek 公司）；2×Taq聚合酶链式反应（PCR）Mastermix[天根生化科技（北京）有限公司]；GF254薄层色谱板（批号：HX17444229，德国Merck公司）；色谱纯乙腈、甲酸（赛默飞世尔科技中国有限公司）；蒸馏水（广州屈臣氏食品饮料有限公司）；其余试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 真菌的分离和鉴定

2.1.1 分离 以通体结香技术处理的白木香为实验材料，取木质部树脂部分和未结香部分，采用传统组织分离法进行真菌分离。以75%乙醇和10%次氯酸钠为消毒剂进行表面灭菌，用无菌水洗净表面残留消毒剂后以无菌滤纸吸干水分，用无菌手术刀将树脂部分和未结香部分切成小块，接种至含50 mg·L–1氨苄青霉素的PDA 培养基中，密封，28 ℃培养3～5 d，菌丝长出后采用菌丝尖端挑取法反复纯化至得到单菌落。

2.1.2 鉴定

2.1.2.1 形态特征 将纯化的菌株接种于PDA 平板上，28 ℃培养3～7 d，观察菌落大小、颜色、菌丝长短、菌落边缘形态等，进行初步形态学分类鉴定。

2.1.2.2 内转录间隔区（ITS）序列分析 使用真菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株的总DNA。以通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增真菌ITS片段。扩增体系为由模板（基因组DNA 20～50 ng·μL–1）2 μL、2×TaqPCR Mastermix 25 μL、引物（10 mol·L–1）各2 μL 和灭菌ddH2O 19 μL。扩增程序为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30 个循环，最后72 ℃延伸7 min。PCR 扩增产物送至上海生工生物有限公司测序，测序结果与美国国家生物技术信息中心（NCBI）核苷酸序列数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）进行比对，确定菌株的种属分类。

2.2 接种与样品前处理

纯化后的真菌于PDA培养基中培养5 d，将菌块接种至马铃薯葡萄糖水（PDB）培养基中，28 ℃、180 r·min–1培养7 d，以无菌纱布滤过得到滤液。选取3年生健康白木香，在离地30 cm 处由下至上每隔20 cm钻1个孔，将滤液注入孔中，以无菌木条封口；注入PDB作为对照（PDB组）。每个处理重复3次。

白木香接种4 个月后剖去接种处树皮与外层木质部，测量每个接种处树脂的延伸长度，用铲刀取下整块树脂部分，阴干。将未结香部分剔除，剩余树脂部分打粉后过二号筛和三号筛，备用。

2.3 薄层鉴别

称取混合均匀的沉香样品粉末（过二号筛）0.5 g，乙醚30 mL提取，超声振荡1 h，滤过，蒸干滤液，残渣加三氯甲烷2 mL 溶解，作为供试品溶液。另取沉香对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。吸取上述溶液各10 µL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，在三氯甲烷-乙醚（10∶1）条件下展开，取出后晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。

2.4 浸出物含量测定

沉香粉碎样品2 g，置100 mL 锥形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，密塞，称定质量，静置1 h。连接冷凝管，加热回流1 h。取下锥形瓶，密塞，放冷至室温，称定质量，95%乙醇补足减失的质量。干燥滤器滤过，精密量取滤液25 mL，置干燥且恒重的蒸发皿中水浴蒸干，105 ℃干燥3 h，干燥器中冷却30 min 后，迅速精密称定质量，以干燥品计算供试品中醇溶性浸出物含量。每个样品重复3次。

2.5 特征图谱分析和沉香四醇含量测定

按照《中国药典》2020 年版[2]方法进行特征图谱分析和沉香四醇含量测定。

3 结果

3.1 内生真菌的分离与鉴定

从白木香中共分离得到48 株内生真菌，其中31株来自树脂部分、17 株来自未结香部分。菌株形态特征和分子生物学初步鉴定结果见表1。部分菌株的菌落及显微照片见图1。

表1 白木香内生真菌的形态特征及分子生物学初步鉴定结果

48 株内生真菌分别为镰刀菌17 株，占35.42%；可可色二孢菌12 株，占25.00%；木霉属13 株，占27.08%；枝孢属2 株，占4.17%；曲霉属2 株，占4.17%；刺盘孢菌属1 株，占2.08%；硬孔菌1 株，占2.08%。镰刀菌是白木香的优势真菌，木霉属和可可色二孢菌次之。

3.2 真菌的结香效果

选取不同种属的10 株内生真菌，经液体培养后滤过，取菌液进行野外结香试验，4 个月后削去接种孔附近树皮与外层木质部。如表2 所示，内生真菌促进白木香产生的树脂与PDB 组比较，结香长度更长、树脂颜色更深，说明真菌在诱导白木香结香方面具有一定效果。在接种孔附近，内生真菌处理组均观察到褐色或棕黑色树脂与黄白色木部相间的斑纹，并呈现出从接种孔向上、向下延伸结香的趋势（图2）。

图2 不同内生真菌促进白木香结香4个月的效果

表2 不同内生真菌处理的沉香样品信息

3.3 沉香的薄层色谱

内生真菌诱导所得树脂粉末的薄层色谱鉴别结果见图3。样品T6、T7、T9 与《中国药典》2020年版规定沉香药材的荧光斑点基本一致，其他样品与对照药材比较，缺少部分荧光斑点。结果表明，刺盘孢菌属、黑曲霉和渐进绿木霉处理得到的树脂符合《中国药典》2020 年版标准。

3.4 沉香的浸出物含量

内生真菌诱导所结沉香的浸出物质量分数见图4，T1（5.76%）、T2（8.68%）、T3（11.76%）、T4（8.83%）、T5（7.79%）、T7（10.16%）、T9（11.40%）与PDB组（6.42%）比较差异有统计学意义（P<0.05），表明内生真菌在促进结香方面有明显作用。其中，T3 诱导4 个月所结沉香的浸出物质量分数最高，T9 和T7 次之，三者浸出物质量分数均大于10%，符合《中国药典》2020年版标准。

3.5 沉香四醇含量测定

内生真菌诱导所结沉香的沉香四醇质量分数见图5，T2（0.036%）、T3（0.070%）、T4（0.142%）、T5（0.078%）、T6（0.168%）、T7（0.124%）、T8（0.160%）、T9（0.141%）、T10（0.356%）与PDB组（0.020%）比较差异有统计学意义（P<0.05），结果表明，内生真菌在促进沉香四醇积累方面发挥作用。其中，T10 的沉香四醇质量分数为PDB 组的17.8 倍，显著高于对照组（P<0.000 1）。T4、T6、T7、T8、T9、T10的沉香四醇质量分数均大于0.1%，符合《中国药典》2020年版标准。

图5 内生真菌诱导所结沉香的沉香四醇质量分数（±s,n=3）

3.6 特征图谱分析

内生真菌诱导所产沉香特征图谱见图6，T4、T6～T10 和对照药材的特征图谱均有6 个特征峰，与《中国药典》2020年版沉香特征图谱的6个特征峰相对应，符合《中国药典》2020 年版标准。T1～T3、T5、PDB组与对照药材比较，缺少部分特征峰。

图6 内生真菌诱导所产沉香的特征图谱

4 讨论

白木香在自然条件下几乎不产生沉香，受到伤害后形成沉香的过程也十分缓慢。为保证沉香的可持续供应，研究人员发明了物理伤害、化学诱导和真菌诱导等方法[11]，其中真菌诱导法因诱导时间短、效果好、安全环保受到持续关注。真菌诱导法多以白木香内生真菌为材料，在白木香茎部注入菌液或填入菌丝，内生真菌侵染木质部促进沉香形成。内生真菌在植物中普遍存在，在影响宿主次生代谢等方面发挥重要作用[12-13]。目前，在多种药用植物中发现内生真菌可提高次生代谢物产量。孙思胜等[14]筛选出镰孢属真菌、拟茎点霉属真菌Phomopsissp.、Pleosporalessp.等6 株真菌，可以在2 个月内诱导降香檀产生黄酮类化合物和醇溶性浸出物。曾旭等[15]发现，赤霉属真菌诱导龙血树产生的血竭与血竭对照药材的指纹图谱相似度可达0.990，并检测出7,4′-二羟基黄酮、龙血素A、白藜芦醇等特征性化学成分。Chen 等[16]发现，硬孔菌可有效促进白木香产生沉香，其诱导的沉香精油中倍半萜类化合物相对含量为22.76%。

本研究对白木香木质部内生真菌进行分离、鉴定，得到48 株菌落形态有差异的真菌，树脂部分分离的菌株多于未结香部分，与王磊等[17]的研究结果相似。选取不同种属的10 株内生真菌进行野外结香试验，4 个月后采集树脂部分，按《中国药典》2020 年版沉香项下薄层鉴别、浸出物含量测定、沉香四醇含量测定和特征图谱要求进行综合分析，结果表明，真菌在结香过程中起到明显的作用。其中，黑曲霉和渐进绿木霉能产生较高品质沉香，检测结果均符合《中国药典》2020 年版标准。王东光等[18]对20 株白木香内生真菌进行结香效果评价，发现其中7 株结香10 个月产沉香的浸出物含量符合《中国药典》2020年版要求，本研究中部分菌株诱导4个月即可达要求。此外，本研究还发现，不同菌株诱导所得沉香的浸出物和沉香四醇含量、薄层色谱斑点和特征图谱有差异。导致这一现象的原因可能是诱导时间短，部分菌株促进效果未能完全体现；也可能是不同真菌的诱导效果不同，推测不同菌株在白木香结香过程中所起的作用不同，作用机制存在差异。

沉香主要成分为倍半萜类和色酮类化合物。部分学者认为，内生真菌可调节沉香树内茉莉酸、水杨酸等植物激素水平，诱导倍半萜合酶基因表达，从而促进倍半萜类和色酮类化合物合成[19-20]；也有学者认为，在真菌体内酶的作用下，白木香木质部中薄壁细胞贮存的淀粉粒转化为可溶性糖，经一系列生物转化，最终形成香脂，经多年沉积形成沉香[21]。黑曲霉是曲霉属真菌中常见的丝状真菌，可分泌纤维素酶、羟化酶和还原酶等多种酶，具有转化倍半萜类、黄酮类等化合物的能力[22-24]。渐进绿木霉是木霉属真菌，木霉是多种酶类的重要来源，具有诱导植物防御反应的能力[25]。黑曲霉及渐进绿木霉诱导沉香形成的机制可能与酶促进生物转化或激发植物产生防御反应有关，还需进一步开展菌液代谢物成分、接种后白木香植物激素、酶类及沉香特征性成分的含量变化研究，以揭示真菌促进白木香产生沉香的作用机制。

本研究报道黑曲霉和渐进绿木霉可促进白木香在短时间内产生符合《中国药典》2020 年版要求的沉香。在取样后继续观察，发现接种孔洞附近沉香仍持续增多，有四周扩散的趋势，可见黑曲霉和渐进绿木霉有持续生产沉香的潜力，具有良好的应用前景，为短时间内可持续生产沉香药材提供菌种资源，有望在沉香生产上得到推广应用。为保证实际生产的产量和品质，下一步可优化黑曲霉和渐进绿木霉的培养条件和接种方式，进行中试放大研究，为规模化应用提供支撑。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。