不同基因型牛病毒性腹泻病毒对BALB/c小鼠致病性研究

刘镝钺，程子龙，陈益，陈思宇，李文良，毛立，杨蕾蕾，孙敏，张纹纹，熊富强，刘茂军，4*

(1. 西藏农牧学院动物科学学院，西藏 林芝 860000；2. 江苏省农业科学院兽医研究所/农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室，江苏 南京 210014；3. 南京农业大学动物医学院，江苏 南京 210095；4. 兽用生物制品(泰州)国泰技术创新中心，江苏 泰州 225300)

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)可以引起牛、羊等多种反刍动物发生病毒性腹泻，该病在世界范围内广泛分布，BVDV自然感染对象主要是奶牛和黄牛，也可感染牦牛、山羊、绵羊和猪等[1]。感染BVDV的牛主要表现为腹泻、消化道黏膜糜烂、产奶量下降、持续性感染、呼吸综合征等[2]，怀孕母牛会发生流产、胎儿畸形、木乃伊胎、死胎、繁殖力下降等繁殖障碍[3]，病牛不仅表现出严重的临床症状，也会出现免疫力下降，从而继发感染其他病原或与其他病原共感染[4]，使患病牛发病率和死亡率大大增加。近年来BVDV感染呈上升趋势，给养牛业造成严重的经济损失[5]。

BVDV是黄病毒科瘟病毒属的成员之一，是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组大小约为12.5 kb[3]。根据5′-非翻译区(5′-UTR)以及Npro、E2基因序列的遗传进化关系，将BVDV分为基因1型(BVDV-1)和基因2型(BVDV-2)，目前已鉴定出BVDV-1至少有22个基因亚型(1a～1v)、BVDV-2有4个基因亚型(2a～2d)[6-7]。根据体外培养是否可以导致细胞病变分为致细胞病变型(cytopathic，CP)和非致细胞病变型(noncytopathic，NCP)2种生物型，在临床中主要分离到的毒株类型是NCP型BVDV[8-9]。BVDV各基因型与基因亚型毒株在抗原性、毒力和致病性等方面存在一定的差异[10]，且仅存在部分交叉保护。随着国际贸易的增加，牛频繁调运，BVDV毒株持续变异，新的基因亚型不断出现。

BVDV感染动物模型的建立一直备受关注，多位学者分别通过不同的感染途径感染新西兰白兔、BALB/c小鼠，探索了BVDV感染的动物模型，证实BVDV可感染新西兰白兔和BALB/c小鼠，可引起病毒血症，均无明显症状[11-14]。不同BVDV基因型之间的致病性差异尚不清楚，本研究利用腹腔注射的方式，分别用本试验分离株JS2201与参考株C24V、C1602建立BALB/c小鼠感染模型，系统地比较了BVDV-1型和BVDV-2型之间的致病性差异，并对目前华东地区分离的流行株致病性进行了分析，为BVDV疫苗的开发以及致病机制的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒与实验动物

MDBK细胞(牛肾细胞)购自美国模式菌种收集中心(ATCC)，由本实验室传代保存，经检测BVDV、支原体阴性。BVDV-1型Oregon C24V株和BVDV-2型C1602株均由本实验室保存，JS2201株(GenBank：OP856581)为本实验室2022年从江苏病死牛的肺脏中分离到的毒株，为BVDV-1b亚型。SPF级雌性BALB/c小鼠(体重18～22 g)购自扬州大学比较医学中心。

1.2 主要试剂

DMEM培养基和胎牛血清(FPS)为Gibco公司产品，经检测BVDV、支原体病原阴性，BVDV抗体阴性。TRIzol购自TaKaRa公司。一步法qRT-PCR试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司。

1.3 BVDV病毒液制备

将生长良好的MDBK单层细胞，倒掉培养细胞的培养基，加入PBS至细胞瓶，轻轻摇晃，倒掉细胞瓶中液体，重复操作3次，按1%的比例分别加入纯化后的BVDV-1型分离株JS2201株、BVDV-2型分离株C1602和标准株Oregon C24V，加入2 mL制备的细胞维持溶液(2%胎牛血清DMEM)，轻轻摇晃细胞瓶中的维持溶液，直到细胞瓶完全覆盖，并将其置于37 ℃、5% CO2培养箱中2 h后，丢弃细胞瓶中的液体，用移液管吸收剩余的液体，然后加入10 mL相同浓度的维持溶液，并将其置于37 ℃、5% CO2培养箱中进行培养。攻毒完成后，每天通过倒置显微镜观察细胞的生长情况。培养2～3 d后，当细胞损伤约80%时收获病毒溶液。将细胞培养物置于-80 ℃冷冻。重复冷冻和解冻3次后，收获病毒溶液20 mL，分装保存于-80 ℃冰箱。

1.4 半数组织细胞感染剂量(TCID50)的测定

将生长良好的单层MDBK细胞，用胰酶消化制备成细胞悬液，使细胞量达到2×105～3×105个/mL，将其加入至96孔细胞板，每孔100 μL，将其置于37 ℃、5% CO2培养箱中过夜培养。将培养好的3株BVDV进行RT-PCR鉴定后[13]，分别用无抗无血清的DMEM将病毒液按照10倍倍比稀释，从10-1稀释到10-8，将稀释好的病毒液加入到细胞长至80%左右的96孔板中，每孔100 μL，每个稀释度做8个重复孔，并设置阴性对照孔(加入100 μL无抗无血清DMEM)，将细胞培养板放置于37 ℃、5% CO2培养箱中；接毒1 h后，弃掉病毒液，每孔加入100 μL含2% FBS的DMEM维持液，将细胞培养板放置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养120 h；通过观察并记录细胞病变孔或者间接免疫荧光记录细胞感染孔，按照Reed-Muench法分别计算Oregon C24V、JS2201、C1602株BVDV的TCID50。

1.5 BALB/c小鼠的致病性试验

将24只BALB/c小鼠随机分为4组，分别为JS2201组、C1602组、C24V组和对照组，每组6只。适应3 d消除应激后，JS2201组、C1602组、C24V组小鼠每只经腹腔注射1 mL相应病毒液，浓度分别为104.5/0.1 mL，104.33/0.1 mL和103.5/0.1 mL进行攻毒，对照组每只注射1 mL MDBK细胞上清液，每天观察记录小鼠的临床症状，及时剖检死亡小鼠，并观察记录剖检病变情况，及时采取样品。

分别于感染0、3、7和10 d测定小鼠体重，感染后3、7和10 d每组各随机选择3只小鼠，通过眼眶采集EDTA抗凝血，用于病毒血症和血常规检测。于感染后的7、10 d，各取3只小鼠的肺、脾、肾、肝等脏器组织，分别测定器官指数和病毒载量，并将肺脏和脾脏用4%多聚甲醛溶液固定后用于病理组织切片制作。

1.6 小鼠血常规检测与病理组织学观察

采集的小鼠血液送南京金域医学检验所进行血常规检测，主要包括白细胞、淋巴细胞及血小板等血细胞计数。小鼠各组织样品经4%多聚甲醛固后送南京烁朴生物科技有限公司进行组织病理学检查。

1.7 荧光定量PCR(RT-qPCR)检测

各组织样品经研磨、反复冻融后，12 000 r/min离心10 min，取上清液。采用TRIzol法提取血液及各脏器组织悬液中的RNA，利用本实验室建立的RT-qPCR方法检测各样品中的BVDV载量。BVDV-F：5′-GTGGTGAGTTCGTTGGATGG-3′，BVDV-R：5′-GGCTGTATTCGTAGCAGTTGAT-3′。反应程序：50 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

1.8 数据分析

每个试验均独立重复3次，测定病毒载量(用Ct值换算出拷贝数)。用GraphPad Prism 8.0软件对试验数据作图及统计分析，并对检测结果进行单因素方差分析，P<0.05为差异显著。

2 结果

2.1 BVDV鉴定及其TCID50测定

通过BVDV 5′UTR片段特异性引物对3种毒株进行RT-PCR鉴定，结果在288 bp处出现目的条带(图1)，大小与预期相符。进一步对扩增产物胶回收、克隆至T载体并进行测序，确定所用毒株均为BVDV。通过测定，JS2201、C1602和Oregon C24V株的TCID50分别为10-4.5/0.1 mL、10-4.33/0.1 mL和10-3.5/0.1 mL。

1. JS2201株；2. C1602株；3. Oregon C24V株；4. 阴性对照；M.DL2000 DNA Marker。

2.2 小鼠的体重变化以及临床症状

通过腹腔注射分别感染3种毒株的小鼠以及对照组小鼠均未表现出明显临床症状。在感染后0～10 d，攻毒组小鼠与对照组小鼠相比体重差异不显著(图2)，表明BVDV感染对小鼠体重无明显影响。

图2 攻毒后BALB/c小鼠体重变化

2.3 攻毒后外周血白细胞、淋巴细胞检测

分别于攻毒后的第3、7和10天采集血液进行血常规测定，结果显示：小鼠血液中白细胞数量，在攻毒后第3天 C24V组比对照组高，但差异不显著(P>0.05)；JS2201组与C1602组均比对照组低，但差异不显著(P>0.05)；JS2201组则显著低于C24V组(P<0.05)。在攻毒后第7天，3组攻毒小鼠白细胞数量均出现下降，且攻毒组均显著低于对照组(P<0.05)。攻毒后第10天，3组攻毒小鼠白细胞数量均有所恢复，但仍低于对照组，差异不显著(P>0.05)(图3A)。

注：*表示P<0.05，**表示P<0.01，下同。

血液中的淋巴细胞数量在攻毒后第3天，C1602、C24V组高于对照组；JS2201组低于对照组，但差异均不显著(P>0.05)；C1602组显著高于JS2201组(P<0.05)。在攻毒后第7天，3组攻毒小鼠淋巴细胞数量降低，并低于对照组，但差异不显著(P>0.05)。攻毒后第10天，JS2201组与C24V组淋巴细胞数量仍低于对照组，C1602组高于对照组，但差异均不显著(P>0.05)(图3B)。

小鼠淋巴细胞百分比在攻毒后第3天，3个攻毒组均显著高于对照组(P<0.05)。在攻毒后第7天和第10天，攻毒组淋巴细胞百分比持续下降，与对照组相比差异不显著(P>0.05)(图3C)。

2.4 剖检病变及病理组织学变化

在攻毒后第7、10天，每组分别随机安乐死3只小鼠，观察各组织器官病变情况。JS2201、C1602、C24V组小鼠在攻毒后第7、10天肺脏均出现轻微的实变和充血，病变程度无明显差异，脾脏均无明显剖检病变，阴性对照组肺脏与脾脏均未观察到明显病变(如图4)。

图4 攻毒后BALB/c小鼠肺脏、脾脏的剖检病变

组织病理学分析显示，JS2201、C1602、C24V株组小鼠在攻毒后第7、10天肺脏可见明显间质性肺炎病变，肺泡间隔明显增宽，肺泡壁及支气管周围可见以淋巴细胞、巨噬细胞为主的炎性细胞浸润，肺泡壁毛细血管充血。其中BVDV-2型C1602株攻毒组小鼠肺脏(图5B、F)相较于JS2201组(图5A、E)和C24V组(图5C、G)表现为更为严重的间质性肺炎，JS2201组和C24V组小鼠肺泡壁毛细血管则表现为较为严重的充血变化，而JS2201与C24V株组小鼠肺脏病变差异不明显；对照组小鼠肺脏无明显病理变化(图5D、H)。

注：黄色箭头为巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润、肺泡间隔变宽；绿色箭头为肺泡壁毛细血管充血。

2.5 攻毒后BALB/c小鼠病毒血症以及各组织器官病毒载量检测

在攻毒后第3、7和10天分别采集各组小鼠血液，在攻毒后第7、10天采集肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、血液等组织器官样品进行病毒载量的检测。结果显示，对照组各组织器官样品都未检测到病毒；各感染组在感染后第3天均出现病毒血症，且持续到第10天仍能检测到；JS2201组小鼠在攻毒后第7、10天血液中病毒含量显著高于C1602组和C24V组(P<0.05)(图6A)。在攻毒后第7、10天，攻毒组小鼠肝脏、脾脏、肺脏、肾脏中均能检测到病毒，在攻毒后第7天，JS2201组小鼠脾脏病毒载量显著高于C24V组(P<0.05)，其余各组织病毒载量差异不显著(P>0.05)(图6B)；在感染后第10天，JS2201组肝脏、脾脏病毒载量显著高于C1602组(P<0.05)，肺脏、肾脏中病毒载量差异不显著(P>0.05)(图6C)。

A.攻毒后各组小鼠病毒血症情况；B、C.攻毒后7、10 d各组小鼠组织器官病毒载量。

3 讨论

健康牛与其他持续感染牛之间的直接或间接接触被认为是BVDV原发感染或继发感染的主要来源，由于其引起免疫抑制，在养牛生产中已造成严重的经济损失。用小鼠等实验动物建立发病模型是研究牛病的重要手段。前期研究表明通过腹腔注射小鼠感染BVDV的成功率高于其他途径，因此，本研究选用腹腔注射方法进行感染。先前有研究报道，感染BVDV的小鼠未出现临床症状[15]，但病毒血症的存在提供了小鼠感染BVDV的证据。在本次研究中，BALB/c小鼠通过腹腔注射感染了BVDV-1型分离株、BVDV-2型分离株和Oregon C24V标准毒株，小鼠也未观察到临床症状，但都出现了病毒血症，结果与之相似。在感染后第7、10天，小鼠剖检可观察到肺脏均出现轻微的实变和充血，不同毒株间病变程度无明显差异，脾脏均无明显剖检病变，阴性对照组肺脏与脾脏均未观察到明显病变，初步证明BVDV能够感染BALB/c小鼠，且能致其组织出现相应病变，但各毒株之间造成的肺脏剖检病变无明显差异。1型、2型BVDV均可成功感染BALB/c小鼠，均可形成病毒血症，且均可以在肝脏、脾脏、肺脏、肾脏中有效复制，但BVDV JS2201分离株在小鼠体内复制能力明显强于C1602株和Oregon C24V株。有研究报道，通过免疫组织化学方法在感染小鼠的脾脏中检测到BVDV抗原[15]，本研究采用RT-qPCR方法检测感染小鼠各组织中病毒载量，结果显示在肺、脾脏器中的病毒载量最高，与报道结果一致。

有研究表明，细胞病变型和非细胞病变型BVDV感染小鼠会导致淋巴细胞耗竭和脾脏中巨核细胞数量增加，以及血小板减少症和淋巴细胞减少症[16-17]，本研究结果与之相似；血常规结果显示，在感染后第7天时，与对照组相比，攻毒组白细胞显著下降，攻毒组淋巴细胞与对照组相比下降，但差异不显著；在感染后第10天时白细胞有所升高，但仍低于对照组；C1602组淋巴细胞上升，高于对照组，JS2201和C24V组仍低于对照组。

以上研究结果表明，BVDV-1型和BVDV-2型分离株和参考株感染BALB/c小鼠后均可在其组织脏器中检测到BVDV，且均能致其肺组织出现一定的病理损伤，与吴陈华等[18]结果相似。总之 ，本研究通过腹腔注射的方式将1型、2型和参考株BVDV感染BALB/c小鼠，根据临床症状和病理变化，血常规、病毒载量等结果，建立了不同亚型BVDV急性感染的小鼠模型，为进一步对BVDV的疫苗研制和致病机理等研究奠定了基础。