罗非鱼抗氧化肽的制备及其抗疲劳功效研究进展

李国祥 安琪

DOI：10.3969/j.issn.1000-9973.2024.03.016

引文格式：李国祥，安琪.罗非鱼抗氧化肽的制备及其抗疲劳功效研究进展[J].中国调味品，2024，49（3）：96-100.

LI G X， AN Q.Research progress on preparation of antioxidant peptides from tilapia and their anti-fatigue effects[J].China Condiment，2024，49（3）：96-100.

摘要：罗非鱼是一种营养丰富的淡水鱼，富含蛋白质，深受消费者喜爱。生物活性肽在食物蛋白中没有生物活性，需要从食物蛋白中释放出来才具有生物活性功效。酶解法是一种高效、安全、反应温和且不会影响蛋白质营养价值的常见生物活性肽制备工艺。基于此，该研究采用单因素试验和正交试验优化罗非鱼的酶解工艺条件，研究结果表明，不同影响因素对低聚肽含量、DPPH自由基清除率和·OH清除率的影响不同；低聚肽含量和抗氧化活性之间无明显关联，最后获得的最佳罗非鱼酶解工艺为酶解温度45 ℃、pH值5、酶解时间4 h和料液比例1∶2，该加工工艺条件下，低聚肽含量为96.8%，DPPH自由基清除率为67.56%，·OH清除率为50.21%，为罗非鱼深加工相关产业的发展奠定了基础。

关键词：低聚肽；酶解法；抗氧化活性；抗疲劳

中图分类号：TS254.1      文献标志码：A      文章编号：1000-9973（2024）03-0096-05

Research Progress on Preparation of Antioxidant Peptides from

Tilapia and Their Anti-Fatigue Effects

LI Guo-xiang， AN Qi

（Zhengzhou Sias University， Xinzheng 451150， China）

Abstract： Tilapia is a nutritious freshwater fish with high protein content， and it is very popular with consumers. Bioactive peptides have no biological activity in food proteins and need to be released from food proteins in order to have bioactive effects. Enzymatic hydrolysis is a common bioactive peptide preparation process that is efficient， safe， mild in reaction， and does not affect the nutritional value of proteins. Based on this， single factor test and orthogonal test are used to optimize the enzymatic hydrolysis process conditions of tilapia in this study. The research results show that different influencing factors have different effects on the oligopeptide content， DPPH free radical scavenging rate and ·OH scavenging rate. There's no obvious correlation between oligopeptide content and antioxidant activity. Finally， the optimal enzymatic hydrolysis process is obtained as follows： enzymatic hydrolysis temperature is 45 ℃， pH value is 5， enzymatic hydrolysis time is 4 h and solid-liquid ratio is 1∶2. Under such processing technology conditions， the oligopeptide content is 96.8%， DPPH free radical scavenging rate is 67.56%， and ·OH scavenging rate is 50.21%， which has laid a foundation for the development of tilapia deep processing related industries.

Key words： oligopeptide; enzymatic hydrolysis method; antioxidant activity; anti-fatigue

收稿日期：2023-08-21

基金項目：2022年河南省软科学研究计划项目（212400410387）

作者简介：李国祥（1989—），男，讲师，硕士，研究方向：运动营养学。

我国罗非鱼的主要产地分布在南方地区，包括江苏、浙江、福建、广东、广西、海南、云南等地[1-2]。据统计，罗非鱼的产量逐年增加[3]。截至2021年，我国罗非鱼的年产量已经超过400万吨，我国是罗非鱼养殖大国，也是全球罗非鱼养殖业的龙头[4-5]。广东、福建和江苏等省份的罗非鱼产量居全国前列[6]。

我国罗非鱼产业的发展受益于其高产、易养殖、抗病能力强等特点，以及政府的支持和投资[7]。近年来，中国罗非鱼的出口量不断增加，远销欧美、东南亚、非洲等地，为我国的渔业经济作出了重要贡献[8]。

罗非鱼是一种营养丰富、高蛋白、低脂肪的淡水鱼类，其肉质细嫩、口感好、营养价值高，每100 g罗非鱼肉中蛋白质含量可达18 g。罗非鱼含有丰富的不饱和脂肪酸，尤其富含ω-3脂肪酸[9-10]，对人体有益，具有降血脂、预防心血管疾病等功能。罗非鱼还含有丰富的矿物质和维生素，如钙、磷、铁、锌、维生素A、维生素B等，能够提高人体免疫力，促进骨骼生长发育[11]。罗非鱼还被认为具有清热解毒、凉血止血等功效，被用于治疗中暑、热病、出血等症状，具有重要的保健作用[12]。

罗非鱼抗氧化肽是指从罗非鱼鱼肉、鱼鳞、鱼皮等部位提取的具有抗氧化作用的多肽分子[13-14]。近年来，罗非鱼抗氧化肽的研究逐渐受到重视。研究表明，罗非鱼抗氧化肽具有较强的自由基清除能力，能抑制氧化反应，减轻细胞氧化应激，预防多种疾病的发生[15]。总的来说，罗非鱼抗氧化肽具有广泛的应用前景，未来还需要进一步研究和开发。

1  材料与方法

1.1  试验材料与试剂

将新鲜罗非鱼去除鱼鳞、头、尾、骨和内脏，清洗干净，制成肉糜，将鱼肉糜用聚乙烯袋分装，于-18 ℃条件下保存备用。

木瓜蛋白酶、DPPH自由基、·OH、三氟乙酸、甘氨酸、酪氨酸、谷胱甘肽、杆菌肽和细胞色素。

1.2  试验仪器

电子天平、pH计、酶标仪、恒温振荡器、离心机、紫外分光光度计和高效液相色谱仪。

1.3  试验方法

1.3.1  酶解产物的制备

将罗非鱼鱼肉糜解冻后，加入一定比例的水搅拌均匀，调节pH值，将其放在恒温水浴锅中进行酶解，在水浴锅中水浴15 min对酶进行灭活，冷却，离心后取上清液，获得罗非鱼蛋白水解物。

1.3.2  单因素试验

以低聚肽含量、DPPH自由基清除率和·OH清除率为指标，研究酶解温度、料液比例、酶解时间和pH值对罗非鱼自溶的影响。在酶解温度55 ℃、酶解时间4 h、料液比例1∶2、pH值5的条件下，研究不同酶解温度（40，45，50，55，60，65 ℃）、pH值（4，4.5，5，5.5，6）、料液比例（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6）、酶解时间（2，3，4，5，6 h）对罗非鱼自溶的影响。

1.3.3  正交试验

在单因素试验的基础上，采用正交试验对罗非鱼自溶条件进行，包括酶解温度（A）、酶解时间（B）和pH值（C），以低聚肽含量、DPPH自由基清除率和·OH清除率为指标，进行正交试验，因素水平表见表1。

1.3.4  DPPH自由基和·OH清除率测定

DPPH自由基清除率和·OH清除率均根据试剂盒说明进行。

1.3.5  数据处理

数据处理采用Design-Expert 11进行方差分析，所有指标均测定3次，取平均值。

2  结果和讨论

2.1  低聚肽（TPHs）的分子量分布

6种标准品按照色谱柱的分离条件进行分离，洗脱色谱图见图1。

根据标准品的相对分子质量的对数值对色谱保留时间作图，获得相对分子质量的校正曲线，见图2。

由图2可知，线性回归方程为y=－4.231 32x+30.231，相关系数R2=0.921 3，表明蛋白质标准品的相对分子质量和保留时间的相关性较高。

由图3可知，罗非鱼经过酶法水解后，大多数大分子蛋白质被转化成小分子肽。分子量小于180 Da的小分子肽被称为游离氨基酸，TPHs中分子量小于1 000 Da的寡肽占比为70.23%，表明该肽段对TPHs的营养价值和生物活性起着主导作用。

2.2  罗非鱼自溶条件筛选

2.2.1  温度对罗非鱼自溶效果的影响

温度是影响酶促反应最重要的因素之一，在合适的温度范围内酶促反应的效果才能达到最大。温度对罗非鱼自溶效果的影响见图4。

由图4可知，溫度在40～60 ℃范围内，低聚肽含量不断升高，说明该温度范围内罗非鱼蛋白酶活性不断增强。当温度大于60 ℃时，低聚肽含量降低。低聚肽的变化曲线并未与罗非鱼酶解产物的抗氧化活性呈正比，说明抗氧化活性不仅与分子量的大小有关，还与分子的结构相关。当温度为55 ℃时，罗非鱼酶解产物的DPPH自由基清除率和·OH清除率都相对较高，所以选择50～60 ℃进行后续正交试验。

2.2.2  pH值对罗非鱼自溶效果的影响

pH值是酶促反应的重要条件，酶的催化作用只有在一定pH值条件下才会表现出来，过酸或过碱的环境均会导致酶蛋白空间结构受到破坏，从而使酶失去活性，造成酶活力下降。pH值对罗非鱼自溶效果的影响见图5。

由图5可知，当pH值为4～5时，随着pH值的不断升高，低聚肽含量不断升高，当pH值为5时，低聚肽含量达到最大值，为55%。之后随着pH值的不断升高，低聚肽含量不断降低，这是由于pH值过高不适合酶活性的呈现，使得酶解效果降低，所以选择pH值4.5～5.5进行后续正交试验。

2.2.3  时间对罗非鱼自溶效果的影响

蛋白质水解度和水解时间虽然有着一定的关系，但是当底物耗尽时，酶的效力将会受到影响。时间对罗非鱼自溶效果的影响见图6。

由图6可知，当时间为2～4 h时，低聚肽含量先降低后升高，之后随着酶解时间的不断增加，低聚肽含量并没有呈现上升的趋势，反而逐渐下降，这主要是由于反应初期底物足够多，与蛋白酶充分反应，被分解成小分子肽，随着时间不断增加，酶解程度不断加深，前期生成的低聚肽被分解成更小的氨基酸，使得低聚肽含量呈现下降趋势。当酶解时间为4 h时，DPPH自由基和·OH清除率均最高，所以选择3～5 h进行后续正交试验。

2.2.4  料液比例对罗非鱼自溶效果的影响

由图7可知，随着料液比例的增加，低聚肽含量不断降低，酶和底物接触的机会逐渐减少，从而影响酶解效果。陈忆凤等[16]在研究鳀鱼酶解工艺时也表明，随着料液比例的增加，鳀鱼的水解度不断降低。当料液比例最小（1∶2）时，低聚肽含量最高，此时DPPH自由基和·OH清除率也最大。

2.3  酶解工藝的优化试验

2.3.1  正交试验结果及分析

使用Design-Expert 12软件进行试验设计，试验方案及结果见表2。拟合与优化低聚肽含量（Y1）、DPPH自由基清除率（Y2）、·OH清除率（Y3）与酶解温度（A）、酶解时间（B）和pH值（C）的二次多元回归方程如下：

Y1=95.23－0.21A－0.20B－0.03C－0.08AB－0.33AC+0.003BC+0.55A2－0.26B2－0.02C2；

Y2=62.11－0.44A+0.51B+2.11C－0.31AB－1.44AC+1.57BC－1.11A2+3.21B2－1.31C2；

Y3=52.12－3.35A－1.13B－0.05C－2.13AB－0.68AC－0.02BC－5.53A2+2.47B2－2.31C2。

2.3.2  回归模型检测

采用回归方差分析对罗非鱼水解产物的低聚肽含量和抗氧化活性的影响因素进行分析，回归模型的各项方差分析结果见表3～表5。

由表3～表5可知，模型的F值分别为73.27，7.52和11.78，P值分别为<0.001，0.007 2和0.003 1，均小于0.05，表明这些影响因素对低聚肽含量和抗氧化活性具有显著影响。失拟项的P值分别为0.117 4，0.532 1和0.265 3，说明二次多项式方程的拟合度较高。

综上所述，回归模型对试验结果的预测和实际因素的拟合效果较好。罗非鱼最佳酶解工艺为酶解温度45 ℃、pH值5、酶解时间4 h和料液比例1∶2，该加工工艺条件下，低聚肽含量为96.8%，DPPH自由基清除率为67.56%，·OH清除率为50.21%。

2.4  罗非鱼小分子肽抗疲劳研究进展

罗非鱼小分子肽是从罗非鱼鱼肉中提取出来的一种生物活性小分子肽，具有很好的抗疲劳作用。随着近年来研究的深入，其抗疲劳作用机制已经得到了一定的认识[17-18]。罗非鱼小分子肽具有很强的抗氧化作用，可以抑制自由基的生成和脂质过氧化的发生，从而减少细胞的氧化损伤，延缓疲劳的发生；罗非鱼小分子肽可以促进细胞内的能量代谢，提高肌肉的能量供应，从而延缓肌肉疲劳；罗非鱼小分子肽可以调节神经内分泌系统的功能，降低身体的应激反应，减少疲劳的发生；罗非鱼小分子肽可以促进肌肉生长，增加肌肉质量和力量，从而提高身体的耐力和抗疲劳能力。

目前，罗非鱼小分子肽的抗疲劳研究已经取得了一定的进展。陈悦等[19]通过体外试验和动物试验的方法，发现罗非鱼小分子肽可以显著减轻运动后的疲劳程度，延长运动时间和距离，提高身体的耐力和抗疲劳能力。此外，一些临床试验也显示，罗非鱼小分子肽可以改善身体的疲劳感，提高生活质量。

虽然罗非鱼小分子肽的抗疲劳作用已经得到了一定的证实，但其具体的作用机制和在临床应用中的安全性和有效性仍需要进一步的研究和验证。

3  小结

在单因素试验的基础上，采用正交试验优化罗非鱼酶解工艺条件，研究结果表明不同影响因素对低聚肽含量、DPPH自由基清除率和·OH清除率的影响不同；低聚肽含量和抗氧化活性之间无明显关联。最后获得的最佳酶解工艺为酶解温度45 ℃、pH值5、酶解时间4 h和料液比例1∶2，该加工工艺条件下，低聚肽含量为96.8%，DPPH自由基清除率为67.56%，·OH清除率为50.21%，为罗非鱼深加工相关产业的发展奠定了基础。

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