金合欢素通过调节Sirt1介导的AMPK/Nrf2信号通路改善肺炎链球菌感染引起的肺泡上皮细胞损伤

范彩霞 张宗林 伏瑶 姜红 （.临沂市人民医院临床药理研究中心，临沂 76000；.临沂市人民医院药学部，临沂 76000； .临沂市人民医院中心实验室，临沂 76000）

肺炎链球菌（Streptococcus pneumonia，SP）是定植于人体上呼吸道的革兰阳性双球菌，人体免疫力减退时可感染肺泡上皮细胞，导致其损伤凋亡，是引发社区获得性肺炎的主要致病原因，严重时会引起败血症［1-2］。机体免疫系统参与介导SP对肺泡上皮细胞的感染过程，免疫细胞活化引发促炎因子与抗炎因子表达失衡，导致持续性炎症和高水平氧化应激，是肺泡上皮细胞受损的主要病理基础，抗炎、抗氧化治疗是减轻肺泡上皮细胞损伤，改善SP所致肺炎的有效方法［3-4］。沉默信息调节因子相关酶1（sirtuin 1，Sirt1）生物学作用广泛，与细胞衰老、自噬、增殖、凋亡等密切相关，可通过激活5'-磷酸腺苷激活的蛋白激酶（5'-AMP activated protein kinase，AMPK）信号促进自噬，降低氧化和内质网应激，抑制炎症，减轻糖尿病引发的肾损伤，还可激活核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）信号减轻肺组织炎症和氧化应激，缓解过敏性气道炎症，因此Sirt1与AMPK/Nrf2是防治SP所致肺炎的潜在作用靶点［5-6］。金合欢素是广泛存在于天然植物的黄酮类化合物，具有多重药理功效，如广谱抗菌消炎、减轻过氧化与应激反应、增强免疫功能等，是治疗新冠肺炎中药方剂黄芪六君子汤的关键成分，可通过激活Sirt1/AMPK信号减轻氧化应激、凋亡和炎症反应，治疗心肌肥厚，可作为防治SP所致肺炎的潜在药物［7-9］。本研究通过SP感染体外培养的A549细胞，探讨金合欢素通过调节Sirt1介导的AMPK/Nrf2信号通路对SP感染引起的肺泡上皮细胞损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺泡上皮细胞A549（STR鉴定正确，货号：CL-0016）、胎牛血清（货号：164210-500）、Ham's F-12K（货号：PM150910）、青-链霉素（货号：PB180120）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；SP（货号：6978）购自宁波明舟生物科技有限公司；SOD活性检测试剂盒（货号：ab65354）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（货号：ab238537）、兔源Ki-67一抗（货号：ab92742）、CCK-8检测试剂盒（货号：ab228554）、兔源Bax一抗（货号：ab32503）、兔源caspase-9一抗（货号：ab32539）、BCA试剂盒（货号：ab102536）、人IL-1β、IL-10、TNF-α ELISA试剂盒（货号：ab214025、ab229436、ab181421）购自美国Abcam公司；兔源Sirt1一抗（货号：2496T）、兔源PCNA一抗（货号：13110T）、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒（货号：V13242）购自美国Cell Signaling Technology公司；ROS检测试剂盒（货号：S0033S）、兔源GAPDH一抗（货号：AF1186）、RIPA裂解液（货号：P0013K）、兔源AMPK一抗（货号：AF6195）、兔源p-AMPK一抗（货号：AF5908）、兔源Nrf2一抗（货号：AF7623）、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（货号：A0208）购自上海碧云天公司；SpectraMaxM5多功能酶标仪购自美谷分子仪器有限公司；DYCZ-24KF电泳仪购自北京六一生物科技有限公司；MiniBlotTM蛋白转膜系统购自上海碧云天公司；MoFlo AstriosEQ流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞损伤模型构建及金合欢素最佳作用浓度筛选 37 ℃水浴快速融化A549细胞，培养基（Ham's F-12K+10%胎牛血清+1%青-链霉素）复苏培养，SP菌株以血平板培养，制成1×108CFU/ml菌液，传代后的A549细胞接种于96孔板，培养12 h，以终浓度0、5、25、50、100、150、200 μmol/L的金合欢素处理细胞48 h［10］，每个浓度设6孔，并选6孔不接种细胞做空白对照，未以金合欢素处理的细胞作为对照组，以终浓度1×108CFU/ml SP菌液感染细胞构建细胞损伤模型［11］，24 h后加入CCK-8处理1 h，酶标仪测量450 nm波长下各孔吸光度（A），细胞活力（%）=（A药物处理组-A空白对照组）（/A对照组-A空白对照组）×100%，筛选金合欢素最佳作用浓度。

1.2.2 分组处理细胞及标本收集 取传代的A549细胞接种于24孔板培养，随机分为对照组、模型组、金合欢素组、EX527组、金合欢素+EX527组。细胞生长12 h后，金合欢素组以终浓度150 μmol/L金合欢素处理；EX527组细胞以终浓度40 μmol/L Sirt1抑制剂EX527处理［12］；金合欢素+EX527组细胞以终浓度150 μmol/L金合欢素处理，同时以终浓度40 μmol/L EX527处理；对照组和模型组细胞不做处理，各组均处理48 h，除对照组外，其余各组以终浓度1×108CFU/ml SP菌液感染细胞构建细胞损伤模型，继续培养24 h分别收集各组细胞和各组细胞培养液。

1.2.3 检测各组细胞增殖和凋亡 取传代培养的A549细胞接种于96孔板，培养12 h，以1.2.2方法分组处理，CCK-8检测各组细胞活力，步骤同1.2.1。取1.2.2收集的各组细胞，PBS重悬，加入Annexin V-FITC和PI避光孵育，离心后洗涤细胞沉淀，再次PBS重悬混匀后流式细胞仪检测。

1.2.4 各组细胞ROS、MDA、SOD、LDH水平及其产生的IL-10、IL-1β、TNF-α水平检测 取1.2.2收集的各组细胞，加入RIPA裂解液冰水浴中提取总蛋白，离心，BCA测量上清中总蛋白浓度，各组取0.2 ml，采用试剂盒测定ROS、MDA、SOD、LDH水平，剩余蛋白样品用于免疫印迹检测。取1.2.2收集的各组细胞培养液，离心后各组取0.2 ml上清，采用试剂盒测定其中IL-10、IL-1β、TNF-α水平。

1.2.5 测定各组细胞Sirt1蛋白、增殖、凋亡相关蛋白、AMPK/Nrf2信号通路相关蛋白表达 取1.2.4中各组剩余的蛋白样品20 μg，变性（100 ℃煮沸5 min）、电泳（120 V恒压80 min）、湿转（120 V恒压90 min）、3%牛血清白蛋白封闭（37.5 ℃孵育2 h），剪下目的蛋白Ki-67、PCNA、caspase-9、Bax、Sirt1、p-AMPK、GAPDH、AMPK、Nrf2，孵育兔源一抗（4 ℃孵育10 h）、洗涤（TBST洗3次，5 min/次）、孵育二抗（37.5 ℃孵育2.5 h）、洗涤（TBST洗3次，5 min/次）、显影（化学发光法）、拍照，Image J软件定量各蛋白灰度并计算其与内参GAPDH的比值，统计学分析可得各组蛋白相对表达。

1.3 统计学分析 数据均以±s表示，计量数据利用SPSS24.0软件进行统计学分析，两组间比较行t检验；组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较行LSD-t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金合欢素对SP感染的A549细胞增殖的影响 金合欢素可促进SP感染的A549细胞生长增殖，一定浓度范围内，浓度越高，细胞活力越强，浓度达到150 μmol/L时，A549细胞生长进入平台期，几乎不再促进其增殖（图1），因此后续实验选择150 μmol/L金合欢素处理SP感染的A549细胞。

图1 不同浓度金合欢素对SP感染的A549细胞活力的影响Fig.1 Effect of different concentration of acacetin on activity of A549 cells infected by SP

2.2 金合欢素对各组A549细胞增殖与凋亡的影响 与对照组比较，模型组A549细胞活力降低（P＜0.05），凋亡率升高（P＜0.05）。与模型组、金合欢素+EX527组分别比较，金合欢素组A549细胞活力均升高（P＜0.05），凋亡率均降低（P＜0.05）；EX527组A549细胞活力均降低（P＜0.05），凋亡率均升高（P＜0.05，图2、表1）。

表1 各组A549细胞活力与凋亡率（±s，n=6）Tab.1 Viability and apoptosis rate of A549 cells in each group （±s，n=6）

表1 各组A549细胞活力与凋亡率（±s，n=6）Tab.1 Viability and apoptosis rate of A549 cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with acacetin+EX527 group，3）P＜0.05.

Groups Control Model Acacetin EX527 Acacetin+EX527 Cell viability/%Apoptosis rate/%2.07±0.30 61.48±5.051）12.02±2.622）3）80.79±10.132）3）56.03±7.11 100.00±0.00 40.75±8.021）89.91±10.342）3）21.86±3.522）3）45.14±8.47

图2 流式细胞术检测A549细胞凋亡Fig.2 Apoptosis of A549 cells detected by flow cytometry

2.3 金合欢素对各组A549细胞SOD、LDH、ROS水平的影响 与对照组比较，模型组A549细胞SOD水平降低（P＜0.05），MDA、LDH与ROS水平升高（P＜0.05）。与模型组、金合欢素+EX527组分别比较，金合欢素组A549细胞SOD水平均升高（P＜0.05），MDA、LDH与ROS水平均降低（P＜0.05）；EX527组A549细胞SOD水平均降低（P＜0.05），MDA、LDH与ROS水平均升高（P＜0.05，表2）。

表2 各组A549细胞SOD、LDH与ROS水平（±s，n=6）Tab.2 SOD， LDH and ROS levels of A549 cells in each group （±s，n=6）

表2 各组A549细胞SOD、LDH与ROS水平（±s，n=6）Tab.2 SOD， LDH and ROS levels of A549 cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with acacetin+EX527 group，3）P＜0.05.

ROS/（U·kg-1·prot-1）0.74±0.13 7.16±1.311）1.03±0.222）3）11.45±1.522）3）6.72±1.09 Groups Control Model Acacetin EX527 Acacetin+EX527 SOD/（U·kg-1·prot-1）12.71±1.62 4.85±0.411）10.43±1.222）3）1.69±0.532）3）5.56±0.70 MDA（mmol·ml-1）2.26±0.18 6.89±0.271）2.84±0.232）3）8.62±0.312）3）6.02±0.21 LDH/（U·L-1）0.57±0.16 1.43±0.241）0.71±0.202）3）2.12±0.252）3）1.26±0.17

2.4 金合欢素对各组A549细胞产生IL-10、IL-1β、TNF-α水平的影响 与对照组比较，模型组A549细胞产生IL-10的水平降低（P＜0.05），IL-1β与TNF-α水平升高（P＜0.05）。与模型组、金合欢素+EX527组分别比较，金合欢素组A549细胞产生IL-10的水平升高（P＜0.05），IL-1β与TNF-α水平均降低（P＜0.05）；EX527组A549细胞产生IL-10的水平均降低（P＜0.05），IL-1β与TNF-α水平均升高（P＜0.05）。见表3。

表3 各组A549细胞产生IL-10、IL-1β、TNF-α的水平（±s，n=6，pg/ml）Tab.3 IL-10， IL-1β and TNF-α levels produced by A549 cells in each group （±s，n=6，pg/ml）

表3 各组A549细胞产生IL-10、IL-1β、TNF-α的水平（±s，n=6，pg/ml）Tab.3 IL-10， IL-1β and TNF-α levels produced by A549 cells in each group （±s，n=6，pg/ml）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with acacetin+EX527 group，3）P＜0.05.

TNF-α 130.52±20.30 494.65±46.181）141.03±24.612）3）675.93±60.352）3）480.74±50.16 Groups Control Model Acacetin EX527 Acacetin+EX527 IL-10 280.73±30.14 52.69±5.211）267.12±32.352）3）18.31±4.232）3）60.45±6.17 IL-1β 23.79±5.14 96.85±11.021）29.83±4.912）3）152.78±17.352）3）87.96±12.03

2.5 金合欢素对各组A549细胞增殖与凋亡相关蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组A549细胞增殖相关蛋白Ki-67与PCNA表达降低（P＜0.05），凋亡相关蛋白caspase-9与Bax表达升高（P＜0.05）。与模型组、金合欢素+EX527组分别比较，金合欢素组A549细胞增殖相关蛋白Ki-67与PCNA表达均升高（P＜0.05），凋亡相关蛋白caspase-9与Bax表达均降低（P＜0.05）；EX527组A549细胞增殖相关蛋白Ki-67与PCNA表达均降低（P＜0.05），凋亡相关蛋白caspase-9与Bax表达均升高（P＜0.05，图3、表4）。

表4 各组A549细胞增殖与凋亡相关蛋白表达（±s，n=6）Tab.4 Proliferation and apoptosis related proteins expressions of A549 cells in each group （±s，n=6）

表4 各组A549细胞增殖与凋亡相关蛋白表达（±s，n=6）Tab.4 Proliferation and apoptosis related proteins expressions of A549 cells in each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with acacetin+EX527 group，3）P＜0.05.

Groups Control Model Acacetin EX527 Acacetin+EX527 Ki-67/GAPDH PCNA/GAPDH caspase-9/GAPDH Bax/GAPDH 0.32±0.05 1.05±0.171）0.41±0.102）3）1.82±0.232）3）0.97±0.14 0.78±0.10 0.39±0.041）0.72±0.122）3）0.11±0.022）3）0.43±0.07 0.94±0.13 0.45±0.091）0.88±0.162）3）0.16±0.042）3）0.50±0.08 0.51±0.07 1.26±0.191）0.60±0.062）3）1.79±0.202）3）1.17±0.18

图3 免疫印迹检测各组细胞增殖与凋亡相关蛋白表达Fig.3 Western blot detects expressions of cell proliferation and apoptosis related proteins in each group

2.6 金合欢素对各组A549细胞Sirt1与AMPK/Nrf2信号通路蛋白表达的影响 与对照组比较，模型组A549细胞p-AMPK/AMPK、Sirt1与Nrf2蛋白表达降低（P＜0.05）。与模型组、金合欢素+EX527组分别比较，金合欢素组A549细胞p-AMPK/AMPK、Sirt1与Nrf2蛋白表达均升高（P＜0.05）；EX527组A549细胞p-AMPK/AMPK、Sirt1与Nrf2蛋白表达均降低（P＜0.05，图4、表5）。

表5 各组A549细胞Sirt1与AMPK/Nrf2信号通路蛋白表达（±s，n=6）Tab.5 Sirt1 and AMPK/Nrf2 signaling pathway proteins expressions in A549 cells of each group （±s，n=6）

表5 各组A549细胞Sirt1与AMPK/Nrf2信号通路蛋白表达（±s，n=6）Tab.5 Sirt1 and AMPK/Nrf2 signaling pathway proteins expressions in A549 cells of each group （±s，n=6）

Note：Compared with control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with acacetin+EX527 group，3）P＜0.05.

Nrf2/GAPDH 1.13±0.21 0.52±0.101）1.02±0.172）3）0.22±0.042）3）0.59±0.09 Groups Control Model Acacetin EX527 Acacetin+EX527 Sirt1/GAPDH 0.82±0.10 0.41±0.061）0.77±0.122）3）0.13±0.032）3）0.46±0.05 p-AMPK/AMPK 0.96±0.13 0.47±0.071）0.90±0.142）3）0.15±0.042）3）0.51±0.06

图4 免疫印迹检测各组A549细胞Sirt1与AMPK/Nrf2信号通路蛋白表达Fig.4 Western blot detects expressions of Sirt1 and AMPK/Nrf2 signaling pathway proteins in A549 cells of each group

3 讨论

SP感染所致肺炎发病率逐年升高，严重影响患者的工作和日常活动，降低其生活质量，已成为我国急需解决的公共卫生问题，抗生素治疗是临床常选策略，但因抗药性对部分患者疗效不佳，研发非抗生素类药物更有临床价值［13-14］。作为人类呼吸道的天然定植菌，SP感染上皮细胞可激活机体免疫反应，促进炎症基因表达，打破氧化还原稳态，引发持续炎症与氧化应激，损伤肺泡上皮细胞，是造成肺炎的主要病理基础，抑制SP感染的肺泡上皮细胞炎症和凋亡是防治SP肺炎的良好途径［15-16］。本文以SP感染A549细胞模拟以上病理过程，结果显示A549细胞被SP感染后，产生的抗炎因子IL-10及抗氧化酶SOD水平明显降低，促炎因子IL-1β、TNF-α水平与ROS水平明显升高，引发强烈炎症及高水平氧化应激，导致MDA、LDH水平升高，最终造成细胞活力降低、损伤凋亡，揭示细胞损伤模型建立成功，可在细胞水平模拟SP肺炎病理过程。

金合欢素是金合欢树、黄芩、菊花等天然植物中提取纯化的化合物，是一种天然抗炎抗氧化剂，在柴胡-黄芩治疗COVID-19所致肺炎过程中发挥重要作用，可通过调控TNF、IL-17等炎症信号抑制炎症和细胞凋亡、减轻肺损伤［7，17］。本实验以金合欢素处理SP感染的A549细胞，可提高细胞产生的抗炎因子IL-10及抗氧化酶SOD水平，降低促炎因子IL-1β、TNF-α、MDA水平与ROS水平，拮抗炎症与氧化应激反应发生发展，增强细胞活力，抑制细胞凋亡，改善细胞损伤，提示金合欢素可通过抗炎与抗氧化功效减轻SP感染的肺泡上皮细胞损伤。

AMPK/Nrf2是调控机体氧化还原稳态与炎症基因表达的重要信号途径，促进其传导可减少促炎因子释放、降低氧化应激和炎症水平，抑制肺细胞凋亡，进而减轻铅诱导的肺损伤［18］。Sirt1也是一种重要的炎症调控分子，可通过抑制NF-κB信号减轻神经炎症，还可激活AMPK和Nrf2信号清除ROS，发挥抗细胞凋亡作用［19-20］。本研究结果显示，SP感染的A549细胞p-AMPK/AMPK、Sirt1、Nrf2蛋白表达均明显降低，Sirt1抑制剂EX527处理可促进炎症与氧化应激发展，加重细胞损伤，说明Sirt1通过调控AMPK/Nrf2信号介导SP感染的肺泡上皮细胞损伤过程。本实验结果表明金合欢素可提高SP感染的A549细胞p-AMPK/AMPK、Sirt1、Nrf2蛋白表达，金合欢素与EX527联合处理SP感染的A549细胞可降低金合欢素的抗炎、抗氧化功效，减弱其对A549细胞凋亡的抑制作用，逆转金合欢素的细胞保护作用，揭示金合欢素减轻SP感染引发的A549细胞损伤是通过上调Sirt1表达，激活AMPK/Nrf2信号实现的。

总之，本实验证明金合欢素可通过上调Sirt1表达促进AMPK/Nrf2信号传导，进而提高抗炎因子及抗氧化酶水平，降低促炎因子水平，减弱氧化应激与炎症反应，最终增强肺泡上皮细胞活力，抑制其损伤凋亡，通过介导Sirt1激活AMPK/Nrf2信号是其分子机制之一。本研究揭示金合欢素可作为防治SP肺炎的候选药物，在临床治疗中具有很好的发展前景。