GGA2在囊泡转运和相关疾病中作用的研究进展*

陶逸豪， 拜尔娜·木太力甫▲， 祁正芳， 刘昶吾， 田 园， 韩洋洋，2，3△

（1新疆医科大学基础医学院生物学教研室，新疆 乌鲁木齐 830017；2新疆地方病分子生物学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830017；3西安交通大学医学部基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，陕西 西安 710061）

囊泡转运（vesicle transport）是大分子及颗粒性物质在细胞器间的跨膜转运方式，参与细胞多项重要的生命活动，如激素分泌、神经递质的释放及信息传递、天然免疫等，反式高尔基体网络（trans-Golgi network， TGN）-内体（endosome）运输作为其中一条途径，参与跨膜蛋白回收和重复利用［1］。TGN-内体运输缺陷引起的蛋白平衡紊乱和细胞功能紊乱，与恶性肿瘤、神经退行性疾病及糖尿病等多种疾病联系密切［2］，如胶质瘤细胞中转接蛋白（adaptor pro‐tein， AP）复合物1σ3 的减少可抑制肿瘤增殖、侵袭和迁移［3］；高尔基体相关、含γ-衔接蛋白耳（gammaadaptin ear， GAE）的ADP 核糖基化因子（ADP-ribo‐sylation factor， ARF）结合蛋白3（Golgi-associated GAE-containing ARF-binding protein 3， GGA3）功能丧失引起β-分泌酶1（β-secretase 1）轴突积聚导致阿尔茨海默病早期病变［4］。因此明确TGN-内体运输关键蛋白功能及机制对揭示其调控囊泡运输障碍引起的疾病机理以及寻找治疗靶点具有重要意义。

GGA 是一类定位于高尔基体、含有γ-衔接蛋白及ARF 结合特性的单体网格接头蛋白家族，包含GGA1、GGA2 和GGA3 三个成员［5］。GGA 蛋白以ARF 依赖的方式定位于TGN 和内体中，属于TGN-内体运输关键蛋白，对网格蛋白包被小泡（clathrincoated vesicles， CCVs）的形成及运输至关重要［6］。由于GGA 结构具有相似性，过去人们认为GGA 在体内的作用和功能是冗余的，但后来发现在分子内自我抑制机制、泛素结合特性、CCVs 组装和基因敲除小鼠表型等方面存在差异。本文综述了GGA2 的结构、GGA2 调控网格蛋白介导的TGN-内体转运，以及GGA2 的研究进展，如与肿瘤、阿尔茨海默病、2 型糖尿病等疾病的关系。

1 GGA2的分子结构

GGA2基因位于16 号染色体短臂（16p12.2），其蛋白分子量为67 kD。外显子跳跃导致GGA2 有两种亚型：GGA2-X1 和GGA2-X2。与GGA2-X1 相比，GGA2-X2 在N 端缺少50 个氨基酸，但保持了C 端两个异构体的同源性。GGA 蛋白具有4 个结构域：VHS ［Vps27/Hrs/STAM （signal transducing adaptor molecule）］结构域、铰链（hinge）结构域、GAT （GGA and Tom1）结构域和GAE结构域（图1）［7］。

Figure 1. Domains of GGA2 and vesicle-associated binding molecules. The GGA2 protein is composed of VHS ［Vps27/Hrs/STAM（signal transducing adaptor molecule）］ domain， GAT（ GGA and Tom1） domain， GAE（ gamma-adaptin ear） domain and hinge domain. The VHS domain consists of eight α-helices， recognizing cargo protein classification signals. The GAT do‐main contains four elongated helices， interacting with ADP-ribosylation factor（ ARF）-GTPase. The GAE domain is a sand‐wich structure formed by multiple β chains through hydrophobic bonds， which binds auxiliary proteins to regulate the cohe‐sion function of GGA2. The hinge domain binding clathrin is the structural basis of GGA2 binding. MPR： mannose 6-phos‐phate receptor； GLUT4： glucose transporter 4； SorLA： sorting protein-related receptor A； EGFR： epidermal growth factor receptor.图1 GGA2结构域及囊泡相关结合分子

（1）VHS结构域：由8个α螺旋组成，可识别货物蛋白共有的酸性簇二亮氨酸（acidic cluster-dileu‐cine， ACLL）分类信号，并受到磷酸化的调控［8-9］。然而，GGA2 与分选蛋白受体A（sorting protein-related receptor A， SorLA）的相互关联不限于ACLL 而依赖货物蛋白中单一的酸性残基和完整的双亮氨酸（dileucine）［10］。同GGA1/3 相比，GGA2 在第6 和7 个α 螺旋之间的环中存在显著差异［11］。VHS 结构域结合磷脂酰肌醇4-激酶β（phosphatidylinositol 4-kinase beta， PI4KB）后，加速CCVs 的形成［12］。（2）铰链结构域：该结构域在GGA之间相似性较低，不同于GGA1/3，GGA2 铰链结构域不含ACLL 序列，无法和自身VHS 结构域绑定实现分子内自我抑制［13］。铰链结构域中2 个保守序列LIDLE 和LLDLL 识别网格蛋白后与之绑定，是GGA2 在TGN-内体转运中纽带作用的结构基础［14］。（3）GAT 结构域：包含4 个螺旋，最长螺旋由N端螺旋-环-螺旋和C端三螺旋束组成［15］。N端亚区与ARF-GTP 酶作用，促使GGA2 由胞浆定位到TGN［16］。（4）GAE 结构域：由多条β 链通过疏水键形成的“三明治”结构，与AP 复合物1（AP complex-1，AP-1）的GAE 结构域和AP-2 的α 亚基同源。GAE 结构域与Rabaptin-5、epsin、γ-synergin、p56、p200 等辅助蛋白绑定以调节GGA2 的衔接功能，这些辅助蛋白含共同序列DFXXØ（Ø 代表色氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸）［17-18］。

2 GGA2调控网格蛋白介导的TGN-内体转运

TGN 是细胞内囊泡运输的主要交通枢纽，参与蛋白质的包装与分类［19］。GGA2 主要调控网格蛋白介导的TGN-内体转运，涉及的蛋白包括小G 蛋白、衔接蛋白、网格蛋白和辅助蛋白，其中衔接蛋白是囊泡形成和转运的关键蛋白，包括异四聚体（衔接蛋白复合物AP 家族）和单体蛋白（GGA 家族）两类。GGA2 通过以下机制调控TGN 与内体之间运输：GGA2 的GAT 结构域与ARF-GTP 酶和磷脂酰肌醇4-磷酸（phosphatidylinositol 4-phosphate， PI4P）相互作用后，GGA2 被招募至TGN，然后VHS 结构域识别货物蛋白ACLL分类信号，并通过铰链结构域与网格蛋白相连，这些蛋白被装配形成CCVs，出芽的CCVs 被锚定至内体并与之融合，辅助蛋白在此过程中调节GGA2 的衔接功能［20］。此外，GGA2 还调控质膜转运，如调节皮质神经元质膜表面的α2B-肾上腺素受体（α2B-adrenergic receptor， α2B-AR）水平［21］。

2.1 GGA2与GGA1/3的不同点 GGA 蛋白在TGN-内体转运中功能大部分冗余，但也有各自特异的功能，如在HeLa 细胞中过表达含DXXLL 分选信号的CD8嵌合体（一种GGA介导的货物蛋白）编码基因，3种GGA 在核周膜上的定位都显著增加，但只有GGA2 降解减少，总体表达水平显著提高［22］，说明CD8 嵌合体的TGN-内体转运可能主要由GGA2介导。

2.1.1 GGA2 被单独募集至TGN GGA 蛋白都介导甘露糖6-磷酸受体（mannose 6-phosphate receptor，MPR）的分拣。沉默GGA2不会改变GGA1/3、阳离子依赖型MPR 或阳离子非依赖型MPR 的细胞内总体分布，过表达GGA2 VHS-GAT 结构域的编码基因不影响3 种GGA 在TGN 的定位，过表达GGA1/3 VHSGAT 结构域的编码基因也不影响GGA2 在TGN 的定位，即GGA2单独于GGA1/3定位至TGN［23］。

2.1.2 GGA2 参与PI4KB 介导的正反馈 GGA2 与PI4KB 的绑定促进GGA2 在TGN 的聚集，PI4KB 催化磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol， PI）合成PI4P，正反馈募集更多GGA2 定位至TGN。虽然GGA1/3 也有以上机制，但PI4KB 优先与GGA2 的VHS 结构域相互作用触发正反馈机制，且只有抑制GGA2 会改变TGN中PI4KB水平［12］。

2.1.3 GGA2 无法发生分子内自我抑制 MPR 的TGN-内体转运主要由GGA2 介导。这是由于GGA1/3 铰链结构含ACLL 分子信号，该信号上游的丝氨酸被酪蛋白激酶2（casein kinase 2）磷酸化后，与自身的VHS 结构域绑定，形成一种阻止与MPR 结合的自我抑制状态。而GGA2 铰链区无ACLL 分子信号，不能发生这种自我抑制，GGA2 的VHS 结构域中暴露的ACLL 分类信号识别MPR 后启始TGN-内体转运［13，24］。以上可能也是GGA1/3 释放货物的一种机制。

2.1.4 GGA2 无法调控泛素化蛋白转运 GGA2 与泛素亲和力远低于GGA1/3，无法调控泛素化蛋白转运。GGA2 不参与主要尿蛋白（major urinary protein）泛素化后运往溶酶体降解［25］。β 位点淀粉样前体蛋白裂解酶1（β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1， BACE1）泛素化后，在GGA3介导下移至溶酶体并被降解［26］。同种货物蛋白也表现出泛素亲和力的差异：表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）刺激后，GGA3 促进表皮生长因子受体（epider‐mal growth factor receptor， EGFR）泛素化，并被溶酶体降解，而GGA2 调控EGFR 逃避泛素化的质膜循环途径，减少EGFR 降解［23］。以上结果也说明，GGA1/3与泛素的高亲和力是其参与泛素化途径降解货物蛋白的前提。

2.2 GGA2 与AP-1 在功能上协同且互补 AP-1 蛋白同时调控TGN-内体和内体-TGN 转运［7］，其GAE可与GGA2 相互关联［27］，两者在TGN-内体转运的关系一直是研究热点。GGA2 与AP-1 可在包裹MPR 的CCVs 共定位，如果GGA2 先与MPR 结合，共定位将很难发生，说明GGA2 和AP-1 相互作用完成MPR 的CCVs装配［24］。Hirst等［28］得出了类似结论：敲除AP-1使GGA2意外缺失，GGA2与AP-1以相互依赖的方式装配到CCVs 中。还有研究显示GGA2 和AP-1 装配至CCVs 的时间顺序，GGA2 首先定位至TGN，诱导PI4KB 催化合成PI4P，随后AP-1 被招募至TGN［29］。GGA2 与AP-1 虽含相同的衔接功能，但不会相互排斥而具有协同作用。Doray 等［30］也检测到两者在功能上互补，GGA 与AP-1 共同介导MPR 的分选，新合成的酸性水解酶含甘露糖6-磷酸（mannose 6-phos‐phate， M6P）标签，与MPR 结合后在衔接蛋白帮助下运往溶酶体。沉默GGA2使组织蛋白酶D（cathepsin D， CTSD）的分选效率从97% 下降到73%，剩余CTSD的分选由AP-1介导。

2.3 GGA2 介导货物蛋白转运 Arn1 是酵母中的铁色素转运蛋白。没有铁色素刺激时，GGA2 介导Arn1的TGN-液泡转运使之降解［31］。GGA2也介导酵母中双碱基内肽酶（paired-basic endopeptidase）的TGN-液泡前体（prevacuolar compartments， PVCs）转运。双碱基内肽酶中第780 位丝氨酸磷酸化后识别GGA2起始TGN运往PVCs［32］。

G 蛋白偶联受体α2B-AR 是迄今唯一观察到的不与GGA2 典型分类信号结合的货物蛋白，而与GAE结构域结合，形成一种独特的运输机制，触发α2B-AR从TGN 运往质膜。GGA2 还调节α2B-AR 的功能，沉默GGA2会抑制α2B-AR 介导的细胞外信号调节激酶激活和环磷酸腺苷水平降低［21］。此外，GGA2还介导SorLA［10］、EGFR［33］等分子的TGN-内体转运（表1）。

表1 GGA2与货物蛋白的结合位点Table 1. Binding site of GGA2 to cargo proteins

3 GGA2与疾病的关系

3.1 GGA2与癌症的关系

3.1.1 GGA2 在恶性肿瘤中的异常表达 GGA2 在一些肿瘤高表达或低表达。GGA2 在30.8%的肝细胞癌和23.3%的结直肠癌中表达上调，并可能支持肝癌和结直肠癌组织生长［33］。GGA2 在伴t（8；16）（p11；p13）易位的小儿急性髓系白血病（acute myeloid leukemia， AML）中高表达，其相对表达中位数高达其他小儿AML 患者的10.7 倍。在AML 细胞系敲除GGA2后，没有观察到细胞显著增殖或凋亡，是否通过其他途径影响白血病有待研究［42］。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白2A（cyclin-dependent kinase in‐hibitor 2A， CDKN2A）在胰腺癌肿瘤中表达上调，且是胰腺癌预后不良的危险因素，而CDKN2A基因拷贝数变异的胰腺癌中GGA2 表达水平显著降低［43］。合并人乳头瘤病毒感染的头颈部鳞状细胞癌中GGA2表达水平显著高于普通头颈部鳞状细胞癌［44］。Yang 等［45］研究证明，GGA2的SNP rs2285521（T>C）位点突变致使肺癌风险显著增加，尤其对于吸烟群体。该突变改变了GGA2的环-茎-环（loop-stem-loop）二级结构。根据GTEx数据库（https：//www.gtexportal.org/home/）和TCGA 数据库（https：//portal. gdc. cancer.gov/）中肺组织数据显示，SNP rs2285521（T>C）位点突变降低GGA2 表达水平，且在肺鳞癌中尤为明显。关于该突变的潜在分子剪接机制及功能有待探索。此外，根据UALCAN 数据库（http：//ualcan.path.uab.edu/），GGA2 在肺腺癌（lung adenocarcinoma， LAC）和肾透明细胞癌中显著低表达，均为预后不良的危险因素。GGA2在不同肿瘤中表达、预后及作用机制的总结见表2。GGA2 可能参与以上肿瘤的发生发展，其与癌症的联系尚未充分探讨。

表2 GGA2在肿瘤中异常表达、预后情况及已知促癌机制Table 2. Abnormal expression of GGA2 in cancer， prognosis and known cancer promotion mechanism

3.1.2 GGA2对肿瘤恶性行为的调控作用 肿瘤异常增殖是肿瘤恶性行为之一。存在于Rab11a 阳性循环内体的AP-1和GGA2促进部分逃脱泛素化途径的EGFR 通过回收利用回到质膜，维持细胞表面EG‐FR 水平，促进癌细胞的生长［46］。目前已知GGA2 结合AP-1 的EAR 结构域可间接识别EGFR［46］，但两者在EGFR 循环途径的关系仍不清楚。在LAC 细胞系中，GGA2与EGFR 具有协同效应：增加EGFR拷贝数激活GGA2转录和增强GGA2 活性；GGA2 通过增加EGFR 稳定性延长其活性，并促进LAC 细胞增殖［47］。酪氨酸激酶抑制剂治疗EGFR 驱动的LAC 已在临床上取得成效，抑制GGA2 使LAC 对酪氨酸激酶抑制剂治疗增敏，是LAC 联合治疗策略的潜在治疗靶点［46］。靶向AP-1/GGA2也可阻断多个受体蛋白酪氨酸激酶（receptor protein tyrosine kinase）介导的肿瘤信号通路，GGA2缺失降低细胞中酪氨酸激酶间充质-上皮转化因子（mesenchymal-epithelial transition fac‐tor， MET）和Erb-B2受体酪氨酸激酶4（Erb-B2 recep‐tor tyrosine kinase 4）水平，从而抑制非小细胞肺癌生长。MET 是一种肝细胞生长因子酪氨酸激酶受体，在肝癌中高表达，GGA2可能对肝细胞癌生长有重要影响［46］。

癌细胞的迁移和侵袭是导致肿瘤进展的重要因素。甘氨酸延伸型胃泌素（glycin-extended gastrin）通过促进GGA2介导的基质金属蛋白酶1（matrix metal‐loproteinase-1， MMP-1）和MMP-3 分泌，提高结肠癌细胞侵袭性［51］。敲减GGA2抑制β1-整合素再循环至质膜，并降低局灶性黏附中β1-整合素活性，抑制癌细胞的迁移和侵袭能力［52］。

3.2 GGA2 对阿尔茨海默病的调控作用 淀粉样β前体蛋白（amyloid-β precursor protein， APP）依次经β-和γ-分泌酶水解生成β-淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ），这两种分泌酶被认为是阿尔茨海默病的主要治疗靶点［53］。在海马组织中，所有GGA 蛋白都在海马神经元中表达，而只有GGA2 在星形胶质细胞中表达，GGA2在海马星形胶质细胞的特殊作用有待研究［54］。虽然星形胶质细胞的数量是神经元的5 倍，并已在星形胶质细胞中观察到APP 水解，但β-分泌酶水平较低，生成的Aβ 是否是阿尔茨海默病患者Aβ 的主要来源仍存争议［40］。GGA2 介导SorLA 从TGN至内体或内体之间转运，SorLA将APP从β-分泌酶活性最佳的早期内体分拣至再循环内体（endocytic recycling compartment），通过非淀粉途径减少Aβ 生成，而GGA2缺失会诱导SorLA 进入降解途径［55］。β-分泌酶ACLL 分类信号中丝氨酸残基磷酸化识别GGA2，触发β-分泌酶运至早期内体以水解APP［56］。GGA2 参与APP 转运及水解，但2 条途径最终作用相反，最终对阿尔茨海默病的影响仍需确定。

3.3 GGA2 参与2 型糖尿病发生 足细胞是唯一表达GGA2 的肾小球细胞，在胰岛素刺激下，GGA2 与衔接蛋白CD2 相关蛋白（CD2-associated protein，CD2AP）共同绑定网格蛋白，将新合成或从质膜内化的葡萄糖转运蛋白4（glucose transporter 4， GLUT4）补充至GLUT4 储存囊泡（GLUT4 storage vesicles，GSVs），GSVs 转移到质膜维持血糖稳定。在肥胖相关性肾小球病进展中，代谢紊乱使足细胞损伤，糖代谢改变尤其是GGA2 介导的胰岛素抵抗，与2 型糖尿病患者的糖尿病肾病发生有关［57］。

3.4GGA2是黄芩苷和茉莉苷治疗脑缺血的关键驱动基因 脑缺血是一种常见的急性脑血管病，已在发展中国家成为继心脏病和肿瘤的第三大致死病因［58］。Li 等［59］研究表明，黄芩苷和茉莉苷通过FoxO信号通路等多个通路在脑缺血治疗发挥联合作用，并确定GGA2作为其中一个关键驱动基因发挥作用，但在黄芩苷和茉莉苷联合治疗中的机制尚不清楚。

4 结语

GGA2 结构和囊泡运输的研究主要集中在10 年前，然而GGA2 在TGN-内体转运中的衔接功能是其主要的生物学特性，不可避免地需要对GGA2 与TGN-内体转运的关系进行阐述。相较于GGA1/3，GGA2 在调控网格蛋白介导的TGN-内体转运中发挥独特和更重要的功能。GGA2 通过介导具重要生物意义的蛋白转运调控许多病理过程，如肿瘤增殖、迁移和侵袭，阿尔茨海默病，2 型糖尿病，以及脑缺血。GGA2/AP-1 调控的EGFR 回收利用可作为一种潜在抗癌策略，但GGA2 在癌症方面的研究不多，大多停留在GGA2 的表达异常，其与癌症中的联系尚未被充分探讨。此外，在小鼠中敲除GGA2而不是GGA1/3导致胚胎或新生儿的高致死率，存活下来的小鼠出生时体重严重减轻，在成年后保持矮小的体型［33，60］，GGA2敲除致死机制仍有待研究。GGA2 介导其他具有重要生物意义的蛋白转运和除囊泡运输外的机制仍需深入探索，以期为临床治疗提供新的策略和靶点。