WIN55212-2通过调控mTOR/HIF-1α/PFKFB3信号通路抑制糖酵解并减轻脓毒症小鼠急性肺损伤*

段倩雯， 董旭鹏， 马 源， 刘 澈， 张 铭， 马玉清

（1兰州大学第一临床医学院，甘肃 兰州 730000；2兰州大学第一医院麻醉科，甘肃 兰州 730000）

脓毒症（sepsis）是一种由宿主反应失调导致的危及生命的器官功能障碍［1］。在脓毒症发展过程中，急性肺损伤（acute lung injury， ALI）/急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome， ARDS）是最常见的器官损伤，ALI/ARDS 患者预后较差，死亡率高达35%～45%［2］，目前仍然是一个医疗危机。

巨噬细胞活化是脓毒症的主要特征，巨噬细胞活化通过Warburg效应（也称为有氧糖酵解或代谢重编程）诱导过度增殖和炎症反应［3］。6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2，6-双磷酸酶3（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2，6-biphosphatase 3， PFKFB3）是PFKFB 家族的同工酶，被称为糖酵解调节剂，是糖酵解关键酶磷酸果糖激酶1 的有效变构调节因子，可维持高糖酵解速率［4］。

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin， mTOR）作为一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是巨噬细胞活化的重要位点［5］。mTOR 激活促进缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的转录及翻译，调控促炎因子并驱动多种糖酵解酶的表达，促进糖代谢从氧化磷酸化转变为糖酵解，为细胞增殖提供能量［6］。研究证实，在巨噬细胞中敲除mTOR相关基因，转录因子HIF-1α 表达降低，从而减少葡萄糖摄取，抑制糖酵解［7］。

WIN55212-2（WIN）是一种非选择性具有抗炎特性的大麻素受体1 和大麻素受体2 激动剂。研究表明，WIN 可以激活大麻素受体2，减少巨噬细胞TNFα 和活性氧的生成产生抗炎和抗氧化作用［8］。Feng等［9］证实，WIN可以通过调节p38MAPK信号通路，降低结肠炎小鼠血浆TNF-α、白细胞介素6（interleukin-6， IL-6）及肠组织MPO 活性，并上调claudin-1 表达，改善肠道屏障功能，减轻肠道炎症反应。WIN 可否通过抑制糖酵解，减轻脓毒症ALI 及其与mTOR/HIF-1α/PFKFB3 信号通路之间的关系，尚未有研究报道。因此，本研究拟建立脂多糖（lipopolysaccha‐ride， LPS）诱导的小鼠脓毒症模型，探讨WIN 是否通过调控mTOR/HIF-1α/PFKFB3 信号通路，抑制糖酵解，缓解脓毒症小鼠ALI。

材料和方法

1 动物

6～8 周龄SP F 级雄性C57BL/6J 小鼠24 只，体重18～22 g，购自兰州大学医学院动物实验中心，动物许可证号：SCXK（甘）2018-0002。遵循实验动物3R 原则。小鼠正常进食，自由进水，人工光照和黑暗时间12 h 交替。本实验符合相关动物伦理法规，获得兰州大学第一医院动物伦理委员会批准，审批号：LDYYLL2023-319。

2 主要试剂与仪器

LPS（Sigma）； WIN55212-2（Cayman）；mTOR 激动剂MHY1485（MCE）；磷酸盐缓冲液（PBS）、4%多聚甲醛固定液（Wabcan）；乳酸、乳酸脱氢酶A（lac‐tate dehydrogenase A， LDHA）、IL-1β 和IL-10 ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）；磷酸化mTOR（p-mTOR）抗体和β-actin 抗体（北京博奥森生物科技有限公司）；HIF-1α 抗体和PFKFB3 抗体（Abcam）；RIPA 蛋白裂解液（北京索莱宝公司）；二甲基亚砜（DMSO）、蛋白Marker和ECL发光液（Biosharp）。

光学显微镜（Olympus）；离心机（Beckman）；酶标仪（Thermo）。

3 实验方法

3.1 动物分组及造模 将24 只小鼠随机分为对照（control）组、LPS 组、LPS+WIN 组 和LPS+WIN+MHY1485 组，每组6 只。造模前禁食12 h，自由进水，腹腔注射LPS（10 mg/kg［10］）制备脓毒症小鼠模型，LPS+WIN 组造模前30 min 腹腔注射1 mg/kg WIN［11］，LPS+WIN+MHY1485 组造模前1 d 腹腔注射10 mg/kg MHY1485［12］，并在造模前30 min 腹腔注射1 mg/kg WIN 和10 mg/kg MHY1485，control 组和LPS组在上述相同时点腹腔注射等体积DMSO 及生理盐水。造模24 h 后观察小鼠毛发、活动和精神等一般状况，有无竖毛及眼角分泌物；摄食、进水及攀爬打斗等行为的活跃程度；对声音、触碰等刺激的行为反应；呼吸频率等判断造模是否成功。水合氯醛4 mL/kg腹腔注射麻醉小鼠后，之后将其仰卧于固定板上；剪去心前区毛发并消毒，以食指指腹定位小鼠心脏搏动区；手持1 mL 注射器穿刺心搏最强处，收集足量血液标本。静置30 min 后以3 000 r/min 离心15 min，取上清液于−80 ℃冰箱储存。心脏取血后处死小鼠。常规剪去毛发、消毒，暴露胸腔；取肺组织，PBS冲洗3遍，取右肺下叶固定于4%多聚甲醛溶液，用于病理学观察；分装剩余标本，−80 ℃冰箱储存，用于后续检测。

3.2 肺指数检测 取肺脏吸干表面水分后称重，计算肺指数［13］。肺指数=肺湿质量（mg）/小鼠体质量（g）×100%。

3.3 观察肺组织病理结构 取肺组织，置于4%的多聚甲醛中固定48 h，脱水后进行石蜡包埋、切片、染色、显微镜下观察肺组织结构变化，肺组织Smith评分［14］按照肺水肿、炎症细胞浸润、肺不张、出血、坏死和透明膜形成进行0～4分的半定量分析。

3.4 ELISA 法检测肺组织炎症因子IL-1β、IL-10 及血清乳酸、LDHA 表达水平 肺组织称重量，按照1 g加入5 mL PBS 的比例加入PBS，在冰水浴中尽量剪碎组织，随后按照每20 mg 肺组织加入150～200 µL RIPA 裂解液的比例加入裂解液，在冰上使用匀浆机制备成10%肺组织匀浆。将制备好的组织匀浆于4 ℃、3 000 r/min离心10 min，离心后的匀浆取上清液进行分装，−80 ℃放置保存。按照ELISA 试剂盒说明检测肺匀浆IL-1β 和IL-10 表达水平。取血清上清液，按照ELISA 试剂盒说明检测血清乳酸和LDHA水平。

3.5 Western blot 检测mTOR/HIF-1α/PFKFB3 信号蛋白的表达水平 取−80 ℃肺组织匀浆，加入RIPA组织裂解液1 mL，裂解30 min，在4 ℃、12 000 r/min离心10 min，转移上清至新的离心管提取组织蛋白。加热变性10 min，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳100 min，转移至聚偏二氟乙烯膜上，洗膜后加入Ⅰ抗（p-mTOR、HIF-1α、PFKFB3和β-actin抗体，1∶2 000 稀释），4 ℃孵育过夜。次日洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶100 000 稀释）37 ℃摇床孵育2 h，TBST 充分洗膜。增强化学发光法显色曝光，采集图像后用ImageJ 软件分析各组条带灰度值，用目标蛋白与内参照蛋白的灰度值比值反映目标蛋白表达量。

4 统计学处理

所有数据采用Graphpad Prism 9.5 软件进行统计学分析并作图，所有数据均以均数±标准差（mean±SD）表示，本研究实验数据均为计量资料且符合正态分布，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 小鼠一般状态

LPS造模24 h后，control组小鼠精神状态、活动、饮食、呼吸及对刺激的反应较造模前无明显改变，LPS 组小鼠精神萎靡，进食进水减少、寒战、呼吸急促，眼角分泌物增多，竖毛，LPS+WIN 组与LPS+WIN+MHY1485 组较LPS 组小鼠上述表现轻微，而LPS+WIN+MHY1485组相较于LPS+WIN 组小鼠上述表现加重。

2 各组小鼠肺指数比较

Control 组、LPS 组、LPS+WIN 组 及LPS+WIN+MHY1485 组小鼠体质量比较差异均无统计学意义。与control 组相比，LPS 组湿肺质量及肺指数增加（P<0.05）；与LPS 组相比，LPS+WIN 组相较于LPS 组湿肺质量及肺指数明显降低（P<0.05）；LPS+WIN+MHY1485 组相比于LPS+WIN 组湿肺质量及肺指数增加（P<0.05），见表1。

表1 各组小鼠肺指数比较Table 1. Comparative analysis of lung index in mice of different groups （Mean±SD. n=6）

3 各组小鼠肺组织病理结构改变

光镜下，control 组肺组织结构完整，肺泡及间质未见水肿及明显炎症浸润，LPS 组肺间质水肿，肺泡明显萎陷，坏死组织出现，肺泡和间质可见大量炎症细胞浸润，肺泡腔可见出血及透明膜形成；LPS+WIN组肺泡充血、出血、炎症渗出、肺泡壁增厚和透明膜形成等损伤有所减轻；LPS+WIN+MHY1485 组肺水肿和肺不张较LPS+WIN 组加重，肺泡及间质炎症细胞浸润增多，肺泡出血增加。与control 组相比，LPS组Smith 评分显著增加（P<0.05）；与LPS 组相比，LPS+WIN 组Smith 评分显著降低（P<0.05） ；LPS+WIN+MHY1485 组较LPS+WIN 组相比Smith 评分增加（P<0.05），见图1。

Figure 1. Pathological alterations and Smith score of lung tissues in mice of different groups（ HE staining， scale bar=100 or 20 µm）.Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs LPS group； ▲P<0.05 vs LPS+WIN group.图1 各组小鼠肺组织病理学变化及Smith评分

4 各组小鼠肺组织IL-1β和IL-10水平

ELISA 检测各组小鼠肺组织匀浆炎症因子IL-1β和IL-10的表达情况，结果显示：与control组相比，LPS 组中IL-1β 表达升高，IL-10 表达下降（P<0.05）；与LPS 组相比，LPS+WIN 组在WIN 预处理后IL-1β表达相对下降而IL-10 表达升高，差异均有统计学意义（P<0.05）。此外，LPS+WIN+MHY1485 组与LPS+WIN 组相比，IL-1β 表达升高，而IL-10 表达下降（P<0.05），见图2。

Figure 2. Levels of IL-1β and IL-10 in lung tissues， and lactic acid and LDHA in the serum of mice in each group. Mean±SD. n=3.*P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs LPS group； ▲P<0.05 vs LPS+WIN group.图2 各组小鼠肺组织IL-1β、IL-10及血清乳酸、LDHA水平

5 各组小鼠血清乳酸和LDHA水平

ELISA 检测各组小鼠血清中糖酵解关键指标表达，结果显示：与control 组相比，LPS 组中乳酸、LDHA 表达显著增加（P<0.05）；而LPS+WIN 组与LPS 组相比，乳酸、LDHA 表达均下降（P<0.05）。LPS+WIN+MHY1485 组 与LPS+WIN 组相比，乳 酸、LDHA表达增加（P<0.05），见图2。

6 各组小鼠肺组织mTOR/HIF-1α/PFKFB3 信号通路蛋白变化

Western blot检测各组小鼠肺组织p-mTOR、HIF-1α、PFKFB3 表达水平，结果显示：与control 组相比，LPS 组小鼠肺组织p-mTOR、HIF-1α、PFKFB3 蛋白表达显著增加（P<0.05）； LPS+WIN 组与LPS 组相比，p-mTOR、HIF-1α、PFKFB3 蛋白表达均下降（P<0.05）；LPS+WIN+MHY1485 组与LPS+WIN 组相比，p-mTOR、HIF-1α、PFKFB3 蛋白表达增加（P<0.05）。见图3。

Figure 3. The protein levels of p-mTOR， HIF-1α and PFKFB3 in the lung tissues of mice in each group. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs control group； #P<0.05 vs LPS group； ▲P<0.05 vs LPS+WIN group.图3 各组小鼠肺组织p-mTOR、HIF-1α和PFKFB3蛋白水平

讨 论

在本研究中，我们采用腹腔注射LPS 建立小鼠脓毒症ALI 模型，造模24 h 后，LPS 组小鼠进食进水量减少，出现精神萎靡、寒战、呼吸急促、眼角分泌物增多、竖毛等症状，肺组织病理学变化出现间质水肿，肺泡明显萎陷，坏死组织出现，肺泡和间质可见大量炎症细胞浸润，肺泡腔可见出血及透明膜形成，肺指数增加，表明小鼠脓毒症ALI模型制备成功。

在脓毒症ALI 发展过程中，炎症反应失调是脓毒症ALI 的主要特征［15］。WIN 是一种具有抗炎特性的大麻素受体激动剂，本研究发现，LPS+WIN组肺组织病理学结果显示炎症浸润、出血及肺泡塌陷等损伤减轻，肺指数降低，表明WIN 对脓毒症ALI 具有一定保护作用，激活大麻素受体2 可以缓解脓毒症ALI［16］。也有研究报道，WIN可逆转LPS刺激后TNFα、IL-1β 和IL-6的水平，抑制巨噬细胞的M1型活化，发挥抗炎作用［17］，这些研究与本研究结果相一致。

LDH 是糖酵解及糖异生的重要酶系之一，促进糖酵解可以上调Warburg 效应相关酶LDHA 及乳酸的表达，因此，LDHA 及乳酸被认为是糖酵解的关键生物标志物［18］。本研究观察到，LPS 组乳酸和LDHA表达增加，肺水肿及肺组织病理损伤严重，表明脓毒症ALI 伴随糖酵解水平上升。WIN 处理后糖酵解相关标志物水平下降，同时肺损伤减轻。推测WIN 减轻脓毒症ALI 的机理，可能是通过调控糖酵解，减轻炎症反应。Endo 等［19］研究发现，抑制mTOR/HIF-1α信号轴可以降低CD4+T 细胞中TNF-α、IFN-γ 的产生和LDH的表达。Kong等［20］用LPS刺激小胶质细胞后发现，单羧酸转运蛋白1（monocarboxylate transporter 1， MCT1）可通过HIF-1α/PFKFB3信号轴诱导炎症因子IL-1β、IL-6 表达增加，敲减MCT1可抑制小胶质细胞极化和糖酵解速率，表明MCT1可能通过促进糖酵解来加速LPS 诱导的小胶质细胞M1 极化，产生促炎作用。本研究发现，LPS+WIN+MHY1485 组经过mTOR 激动剂MHY1485 预处理后，脓毒症ALI 小鼠肺组织p-mTOR、HIF-1α 及PFKFB3 表达上升，而LPS+WIN 组上述蛋白的表达下调，推测WIN 可能通过mTOR/HIF-1α/PFKFB3信号通路抑制糖酵解。

糖酵解增加与脓毒症过度炎症反应密切相关，因此，糖酵解的调节成为脓毒症干预的潜在策略［21］。Zhong 等［22］发现，在ALI 期间糖酵解增强，用2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG，糖酵解抑制剂）抑制糖酵解后，IL-1β及TNF-α表达降低，说明糖酵解增强后，炎症因子表达升高，损伤加重。IL-1β 的产生和释放依赖于炎症小体的活化。研究发现，IL-1β 可以增加糖酵解速率和PFKFB3 表达，证明PFKFB3 与IL-1β 的产生呈正相关［23］。IL-10 是重要的抗炎因子，通过抑制炎症反应在脓毒症过程中发挥重要作用。本研究显示，LPS+WIN组IL-1β表达下调，抗炎因子IL-10升高，肺组织损伤减轻，而LPS+WIN+MHY1485 组IL-1β 表达增加，而IL-10 水平下降，肺组织损伤加重，呈现出与LPS+WIN 组相反的趋势，表明MHY1485逆转了WIN抑制糖酵解和炎症的作用。因此，推测WIN 可能通过抑制mTOR/HIF-1α/PFKFB3 信号通路，调控糖酵解速率，减少炎症因子的表达，缓解脓毒症ALI。

本实验目前仍存在几个局限性。首先，本实验仅在动物实验水平进行了探讨，未在细胞水平进行验证。其次，WIN 也可能通过其他信号通路发挥作用，仍需进一步深入研究。

综上所述，在LPS 诱导的ALI 模型中，WIN 通过调控mTOR/HIF-1α/PFKFB3 信号通路，抑制糖酵解，降低炎症因子的表达，减轻脓毒症ALI。