温阳生肌膏调控GRP78/CHOP通路抑制过度内质网应激促糖尿病难愈合创面修复*

丁雅容， 郑时旭， 王 君， 谢晨磊， 奉水华， 周忠志，△， 陈 丽△

（1湖南中医药大学第一附属医院烧伤疮疡整形科，湖南 长沙 410007；2湖南中医药大学血管生物学与转化医学湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208；3海南省人民医院，海南 海口 570311）

糖尿病是以血糖浓度持续性升高为主要临床特征的慢性代谢性疾病，目前全球发病人数已达5.37亿，而中国约有1.12 亿，糖尿病广泛影响人体各器官代谢功能，使机体出现多种并发症，严重威胁人类的生命健康［1］。糖尿病难愈合创面是糖尿病主要并发症之一，并发率高达19%～34%，患者常由于肢体坏死而截肢或出现感染而导致死亡，且经过治疗后创面复发率高达 65%，给患者及其家庭造成沉重负担［2-3］。研究发现，糖尿病环境导致进行性增强的内质网应激（endoplasmic reticulum stress， ERS）并造成下游一系列病理生理变化可能是糖尿病难愈合创面发病及迁延的关键原因［4］。生理状态下，当细胞受到外界刺激时，内质网发生ERS 进而激活蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R-like endoplasmic re‐ticulum kinase， PERK）、IRE1/X-box 结合蛋白1（Xbox binding protein-1，XBP-1）、激活转录因子6（acti‐vating transcription factor 6，ATF6）介导未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）清除错误折叠蛋白以恢复细胞功能［5］。而当高糖环境持续损伤细胞时，PERK、XBP-1、ATF6的共同解离调控因子葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78， CRP78）将会显著上调，从而使ERS 过度激活并引起下游CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/nhancer binding protein homologous protein， CHOP）大量增加，引起procaspase-12 大量活化为caspase-12，引发细胞凋亡，介导疾病发生［6］，但此机制在糖尿病难愈合创面中的相关研究却少见报道。

温阳生肌膏（WYSJG）由丁香、肉桂、乳香和没药精密配伍而成，具有温阳祛腐、活血生肌之功效，前期研究已发现其可促进糖尿病患者及大鼠难愈合创面修复［7-8］，但其具体机制仍未阐明。现代药理学研究发现，温阳生肌膏中有效成分没食子酸等物质干预可降低大鼠糖尿病难愈合创面ERS 水平、IL-6、TNF-α 等炎症因子含量并减轻相关损伤［9］。但其是否可通过降低GRP78/CHOP 通路抑制过度ERS，减少创面细胞凋亡促进糖尿病难愈合创面愈合却并不明确。因此，本研究通过制备大鼠糖尿病难愈合创面模型，观察温阳生肌膏干预后的治疗作用及其对GRP78/CHOP 通路的影响，探究温阳生肌膏治疗糖尿病难愈合创面的相关机制，为其临床治疗糖尿病难愈合创面的深入研究提供实验基础。

材料和方法

1 动物

SPF 级SD 大鼠，雄性，体质量180～220 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。饲养及实验操作均在湖南中医药大学第一附属医院医学创新实验中心屏障动物实验设施内进行，实验单位使用许可证编号：SYXK（湘）2019-0009。本实验已通过湖南中医药大学实验动物中心伦理委员会审查，伦理批号：ZYFY20221111-53。

2 实验主要试剂和仪器

2.1 实验药物 温阳生肌膏：丁香、肉桂、乳香和没药组成，由湖南中医药大学第一附属医院制剂科制备。贝复新，即重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用凝胶（recombinant bovine basic fibroblast growth fac‐tor gel，rb-bFGF）购自珠海亿胜生物制药有限公司。

2.2 实验试剂 高脂饲料购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司；链脲霉素（streptozotocin， STZ）、苏木素-伊红（hematoxylin-eosin， HE）染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；DAB 染液和HRP 山羊抗兔Ⅱ抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；山羊抗兔荧光Ⅱ抗购自武汉亚科因生物科技有限公司；GRP78 和CHOP 抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；兔抗caspase-12 和β-actin 抗体购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；化学发光显影液和蛋白分子量Marker 购自Thermo Fisher；IL-1β ELISA 检测试剂盒购自杭州联科生物技术股份有限公司

2.3 实验仪器 RM2235 型切片机、Histocore pearl型全自动脱水机和Histocore Arcadiah 型全自动包埋机购自上海徕卡仪器有限公司；PANNORAMIC 型扫片机购自3DHIESTECH；Axio Examiner 荧光显微镜购自卡尔蔡司光学（中国）有限公司；PowerPacBasic电泳转膜装置、721BR17573 ChemiDoc XRS 和化学发光成像分析仪购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司；Spark 多功能酶标仪购自帝肯（上海）实验器材有限公司；透射电镜购自日立（中国）有限公司。

3 主要方法

3.1 大鼠糖尿病难愈合创面模型制备 高脂饲料连续喂养30 d 后连续7 d 按照20 mg/kg 剂量肌肉注射氢化可的松，再以45 mg/kg剂量腹腔注射STZ。若大鼠随机血糖值连续3 d≥16.7 mmol/L，则认为糖尿病大鼠模型成功。随后用4%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，在背侧部位置备皮，形成两个4 cm×4 cm 正方形裸皮区域，依次用络合碘与75%乙醇消毒，在大鼠背部手术形成两个直径为1 cm的圆形全层皮肤缺损创面，造模后若出现创面散漫，平坦塌陷，肉芽生长缓慢、颜色苍白等特征，则认为大鼠糖尿病难愈合创面模型成功［10］。

3.2 分组及处理 正常对照（control）组7 只大鼠创面常规消毒后予生理盐水涂抹；将糖尿病难愈合创面建模成功的大鼠随机分为模型（model组）、温阳生肌膏（WYSJG）组和贝复新（rb-bFGF）组，每组7 只。模型组创面常规消毒后予生理盐水涂抹，温阳生肌膏组创面局部外敷温阳生肌膏，贝复新组创面外敷贝复新，每日换药1次在处理后的0、5、9和14 d对创面进行拍照记录，于处理后14 d用4%成巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉。以创面为中心取得大小为2 cm×2 cm 的标本，一侧创面组织于4%多聚甲醛瓶中固定，常温保存，用于组织病理学检测，另一侧于−80 ℃冻存，用于分子生物学检测。

3.3 创面愈合观察及愈合率计算 创面愈合情况及创面愈合率计算分别于干预后0、5、9 和14 d 观察各组大鼠创面愈合情况，并用图像分析软件ImageJ测定拍摄创面的面积计算创面愈合率。创面愈合率（%）=（原创面面积−相应观察时间点创面面积）/原创面面积×100%。

3.4 创面组织显微形态 创面组织病理形态观察大鼠取材后，于4%多聚甲醛中固定24～48 h，乙醇浓度梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，石蜡切片，片厚4 µm，采用HE 染色制片观察局部组织炎症细胞浸润、肉芽组织生长情况。

3.5 Western blot 法检测创面组织GRP78、CHOP 和caspase-12 含量 皮肤创面组织解冻后于RIPA 裂解液研磨，离心取上清，BCA 法测定总蛋白浓度，选择蛋白质量为20 µg 进行电泳。恒压60 V 将溴酚蓝指示线跑至浓缩胶分离胶交界线后转100V 跑至胶板底部；恒电流200 mA，100 min 转膜； 10%脱脂奶粉溶液37 ℃ 孵育2 h进行封闭；加入Ⅰ抗4 ℃摇晃孵育过夜；洗膜后以HRP 标记的山羊抗兔Ⅱ抗（1∶5 000）室温孵育；洗膜后滴加ECL 显影液后以显影仪显影。后以ImageJ 软件计算条带平均灰度值，以β-actin 为内参照，反映各组蛋白相对含量。

3.6 免疫组织化学法检测GRP78、CHOP和caspase-12 表达及分布情况 组织切片常规脱蜡、复水后，EDTA 高压热修复，加过氧化物酶阻断剂，3% BSA 封闭，孵育待检蛋白Ⅰ抗（GRP78、CHOP 和caspase-12抗体，1∶200），4 ℃冰箱静置过夜，加入HRP 标记的Ⅱ抗（1∶400），37 ℃避光孵育1 h；采用PBST 洗涤3次，DAB 显色，苏木素复染后树脂胶封片。显微镜下检测大鼠创面细胞GRP78、CHOP 和caspase-12 显色及分布情况，用ImageJ 软件测定各指标的阳染情况，以阳性表达量来表示单位面积蛋白表达水平。

3.7 透射电镜观察创面组织内质网数量及形态情况 洗净创面组织戊二醛后，1%锇酸固定液室温避光固定50 min。之后进行梯度脱水：50%丙酮、70%丙酮、90%丙酮、100%丙酮Ⅰ 15 min，100%丙酮Ⅱ15 min。组织浸透：100%丙酮+电镜树脂包埋液（由Eponate 12 Resin、DDSA、NMA 和DMP-30 混合配制而成）1∶1 混合配置，37 ℃，12 h。树脂包埋后，放入恒温烘箱37 ℃烘烤12 h；电镜组织树脂固化，60 ℃恒温烘箱内48 h；样本进行修整并切片（厚度为50 nm）；3%醋酸铀和硝酸铅双重染色；日立HT600透射电镜下观察并拍照。

3.8 ELISA 检测创面组织炎症因子IL-1β 含量 皮肤创面组织解冻后于RIPA 裂解液研磨，离心取上清。分别设空白孔、待测样品孔，按照相关试剂盒步骤检测创面组织炎症因子IL-1β 含量的水平。用酶标仪在450 nm 波长依序测量各孔的光密度（A）值以表征各指标含量。

4 统计学处理

用SPSS 26.0统计软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差（mean±SD）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 温阳生肌膏对糖尿病大鼠难愈合创面愈合情况的影响

如图1所示，各组大鼠干预后分别于0、5、9、14 d观察其创面愈合情况。干预5 d 后，除模型组外，其余各组创面组织干燥结痂、分泌物基本消失、创缘收敛情况较好；而模型组仍有大量渗出、愈合情况差、且创缘未观察到明显收敛现象。干预9 d后，模型组创缘及创面明显红肿，且存在较多红色分泌物，创面未见明显愈合；而温阳生肌膏组创面明显愈合，创面愈合情况良好，且基本无明显红肿等炎症表现。干预14 d 后，正常组、温阳生肌膏组、贝复新组创面均已基本愈合，且温阳生肌膏组愈合效果优于贝复新组；而模型组创面仍存在少量渗出及红肿表现，上皮化情况不佳，创面情况差。

Figure 1. Observation of healing of refractory wounds in diabetic rats. The representative pictures of the 4 groups indicate the healing process at different time points. Each image is represented as a square measuring 1.5 cm on each side.图1 糖尿病大鼠难愈合创面的愈合情况

2 温阳生肌膏对糖尿病大鼠难愈合创面愈合率的影响

如图2所示，干预5、9和14 d后，与正常组对比，模型组愈合率显著降低（P<0.01）；与模型组对比，温阳生肌膏组及贝复新组创面愈合率显著增加（P<0.01）；与温阳生肌膏组对比，贝复新组愈合率虽出现降低但差异无统计学意义（P>0.05）。

Figure 2. The healing rate of refractory wounds in diabetic rats.Wound healing results are presented as the percentages of the initial area. Mean±SD. n=5. ##P<0.01 vs con‐trol group； **P<0.01 vs model group.图2 糖尿病大鼠难愈合创面愈合率

3 温阳生肌膏对糖尿病大鼠难愈合创面组织显微形态的观察

如图3 所示，干预14 d 后取材，通过对创面组织HE 染色后在显微镜下观察发现，正常组创面皮肤层次分明，各层结构排列有序，肉芽组织形成良好，局部炎症细胞浸润已基本消散；模型组创面皮肤组织层次欠清晰，细胞形态不佳，同时可见较多炎症细胞浸润，肉芽生长停滞；而与模型组对比，温阳生肌膏组与贝复新组创面皮肤组织层次完整清晰，肉芽组织生长良好并富含新生血管，且炎症细胞仅存在少量浸润。

Figure 3. Observation of wound tissue micromorphology in diabetic rats. Arrows in A： hair follicle； arrows in B， E and F： granula‐tion tissue； arrows in C： inflammatory cells； arrows in D， G and H： red blood cells.图3 糖尿病大鼠难愈合创面组织显微形态的观察

4 温阳生肌膏对糖尿病大鼠难愈合创面GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表达情况的影响

Western blot法实验结果显示，与正常组对比，模型组大鼠创面组织GRP78、CHOP 和caspase-12 蛋白表达量明显增加（P<0.01）；而与模型组对比，温阳生肌膏组GRP78、CHOP 和caspase-12 蛋白含量显著下降（P<0.01），贝复新组GRP78、CHOP 和caspase-12蛋白含量显著下降（P<0.01）；与温阳生肌膏组对比，贝复新组GRP78、CHOP 和caspase-12 蛋白含量增加，但差异无统计学意义（P>0.05），见图4。

Figure 4. The protein expression of GRP78， CHOP and caspase-12 in refractory wounds of diabetic rats detected by Western blot.Mean±SD. n=3. ##P<0.01 vs control group； **P<0.01 vs model group.图4 Western blot检测糖尿病大鼠难愈合创面GRP78、CHOP和caspase-12蛋白表达情况

如图5 所示，干预14 d 后取材，以免疫组化法检测大鼠创面组织GRP78、CHOP和caspase-12蛋白在创面组织中的分布情况及含量。通过ImageJ 软件进一步对创面组织阳性染色平均光密度值分析，与正常组对比，模型组GRP78、CHOP 和caspase-12 蛋白含量均显著增加（P<0.01）；与模型组对比，温阳生肌膏组与贝复新组GRP78、CHOP和caspase-12蛋白含量均显著降低（P<0.01）；而贝复新组GRP78、CHOP 和caspase-12 蛋白含量则高于温阳生肌膏组，但差异无统计学意义。

5 温阳生肌膏对糖尿病大鼠难愈合创面内质网数量及形态的影响

干预14 d 后取材，以透射电镜观察各组大鼠创面组织内质网数量及形态。结果显示：正常组内质网数量适中，且折叠情况良好，形态正常；模型组内质网数量明显减少，仅存内质网口径增加，肿胀明显；温阳生肌膏组内质网含量丰富，形态规则且折叠整齐；贝复新组内质网含量较多，折叠情况良好但稍有肿胀，见图6。

6 温阳生肌膏对糖尿病大鼠难愈合创面组织中炎症因子IL-1β含量的影响

干预14 d 后取材，以ELISA 法检测各组大鼠创面组织炎症因子IL-1β含量。干预14 d后，与正常组对比，模型组IL-1β 含量上调（P<0.01）；与模型组对比，温阳生肌膏组与贝复新组IL-1β 含量下调（P<0.01）；而贝复新组IL-1β含量高于温阳生肌膏组，但二者之间不存在统计学差异，见图7。

Figure 7. Alterations of IL-1β content in refractory wounds of rats in different groups. Mean±SD. n=5. ##P<0.01 vs control group； **P<0.01 vs model group.图7 糖尿病大鼠难愈合创面组织炎症因子IL-1β含量变化

讨 论

糖尿病难愈合创面是糖尿病常见的并发症之一，具有迁延不愈、护理难度高、易再发等与常规创面不同的特点，是临床常见的慢性创面类型［11］。过往研究发现，糖尿病难愈合创面发病机制复杂，主要涉及糖代谢异常、周围神经病变、微循环血管病变以及上述机制引起的创面细胞功能异常［12］。但最新研究发现，过度ERS 在糖尿病难愈合创面发生发展中具有重要意义［4］。Chu 等［13］的研究表明，在糖尿病难愈合创面中炎症介质中性粒细胞外陷阱（NETs）与CHOP、caspase-12等ERS 指标将会明显上升，而通过治疗后发现前述指标均下调且创面愈合速度显著加快，这提示降低过度ERS 对治疗糖尿病难愈合创面具有潜在价值。但ERS 参与糖尿病难愈合创面发病的机制及针对该靶点对其进行干预的措施仍需进一步探究。

内质网是真核细胞生物进行蛋白质合成与折叠的重要场所，是维持各类生命活动正常进行的重要基石，其功能障碍是多种疾病发生发展的主要原因［14］。目前，糖尿病环境引起过度ERS 导致糖尿病发病与糖尿病心肌病、微血管病变等系统并发症发病的关系已被证实［15-17］，但其在糖尿病难愈合创面修复中的作用仍未明确。本研究发现，模型组大鼠创面愈合速率显著减缓，且创面颜色晦暗，HE 染色显示其创面显微结构混乱，炎症细胞大量增加，符合既往研究报道［18］；进一步检测ERS 主要相关因子GRP78 和CHOP 的含量发现，上述指标在模型组表达显著上调，证明过度ERS 在糖尿病难愈合创面中具有重要作用。而本研究所研究药物温阳生肌膏干预后可显著增加大鼠创面愈合率，同时显著降低了GRP78和CHOP含量，减轻ERS水平。

细胞凋亡是过度ERS 介导各类疾病发生的主要途径之一［19］，高糖环境可导致过度ERS 进而激活CHOP 相关的凋亡信号传递，引起procaspase-12大量活化为caspase-12，使细胞凋亡持续发生［20］。此外，过度ERS 也会导致等炎症因子大量表达，从而介导细胞凋亡，导致疾病发生［20］。本研究结果发现，cas‐pase-12 和IL-1β 在模型组中表达明显上升，而温阳生肌膏干预则可显著逆转上述现象。同时，通过电子显微镜观察发现，糖尿病大鼠创面组织内质网明显较正常组肿胀、折叠结构消失且数量明显减少，而温阳生肌膏干预后上述情况则可明显改善。

本研究所用药物温阳生肌膏由丁香、肉桂、乳香、没药配伍而成，团队前期研究发现其对糖尿病难愈合创面具有显著疗效［7-8］。但其作用与调控ERS减少创面组织细胞凋亡之间是否有关并不明确。本研究首次发现，温阳生肌膏干预可显著减少糖尿病难愈合创面组织GRP78 和CHOP 蛋白含量，从而下调通过下调GRP78/CHOP 通路进而抑制ERS 产生损伤，降低caspase-12表达水平，减轻细胞凋亡水平，同时降低促炎因子IL-1β 的表达，减轻创面炎症反应，最终促进SD 大鼠糖尿病难愈合创面愈合。本研究所使用阳性对照药物rb-bFGF 是一种成纤维细胞生长因子，是创面组织修复与再生领域的经典药物之一，其可通过促进血管新生、纤维组织修复与细胞增殖进而加速创面修复［22］。本研究发现，rb-bFGF 对糖尿病难愈合创面仍有显著促愈合作用，且与温阳生肌膏相同的调控GRP78/CHOP 通路降低caspase-12介导的细胞凋亡与炎症反应，但效果稍低于温阳生肌膏。本团队前期对温阳生肌膏内有效单体成分没食子酸进行研究发现，没食子酸可显著减轻高糖诱导的成纤维细胞氧化应激与炎症反应，进而恢复成纤维细胞增殖活性与胶原蛋白含量［23］。因此我们推测温阳生肌膏调控GRP78/CHOP 通路抑制过度内质网应激促糖尿病难愈合创面修复的靶点之一可能是创面相关的成纤维细胞。但其具体机制可能需要进一步明确。

综上所述，温阳生肌膏可显著促进糖尿病难愈合创面修复，其作用可能是通过抑制GRP78/CHOP通路，减少过度ERS 从而降低创面组织凋亡水平而实现，为进一步临床运用温阳生肌膏治疗糖尿病难愈合创面提供了科学依据。