姜黄素通过下调HO-1/NQO1保护肝癌模型小鼠*

牟海军， 陈幸幸， 刘安安， 张 丽， 朱加兴， 金 海

（遵义医科大学附属医院消化病医院，遵义医科大学附属医院消化内科，贵州 遵义 563000）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是世界上第六大常见癌症［1］。其发病率和死亡率占我国恶性肿瘤前5 位［2］。HCC 的发生发展是一个慢性多阶段的病理过程，并且伴随各种基因的改变。抗肿瘤药物的作用机制也是多种多样，中药因其药效多样，副作用少，增强免疫力且不易产生耐药等优点，在肿瘤治疗方面一直是人们关注的热点。姜黄素是中药材姜黄中含有的一种天然抗氧化物质，可调节细胞周期、增殖、清除氧自由基、抑制肿瘤生长，还具有较强的抗病毒和肝功能保护作用［3-4］。近期研究显示，姜黄素可能同时作用于多条信号通路发挥抗癌作用。对前列腺癌［5］、结直肠癌［6］、肺癌［7］等疾病均有较好的作用，在肿瘤的防治具有良好的应用前景。本研究采用N-亚硝基二乙胺（N-nitrosodiethylamine，DEN）联合四氯化碳（carbon tetrachloride， CCl4）诱导C57BL/6J 小鼠肝癌模型，以观察姜黄素对小鼠肝癌模型发生发展的影响，并探究其机制。

材料和方法

1 材料

1.1 动物 SPF 级C57BL/6J 小鼠30 只（雌性20 只，雄性10只），5周龄，体重19～22 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0002。动物均饲养于遵义医科大学附属医院实验动物中心，环境温度（22±2） ℃、湿度50%±10%、明暗周期 12 h/12 h，自由摄食和饮水。动物实验经遵义医科大学附属医院实验动物伦理委员会批准。

1.2 药品及主要试剂 姜黄素（纯度≥75.0%； CAS：458-37-7； CB0346）购自上海生工生物工程股份有限公司；DEN（N0756）购自Sigma；CCl4（C11605036）购自上海麦克林生化科技有限公司；逆转录试剂盒（AQ601）、荧光PCR 扩增酶（AE311）和β-actin 抗体（HC201）购自北京全式金生物技术有限公司；血红素加氧酶1（heme oxygenase-1， HO-1）、NAD（P）H-醌氧化还原酶1［NAD（P）H-quinone oxidoreductase 1，NQO1］和β-actin引物由南京金斯瑞生物科技有限公司设计及合成；HO-1 抗体（ab13248）购自Abcam；NQO1 抗体（BM4978）和Ki67 抗体（A00254）购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3 主要仪器 5849R 型高速冷冻离心机（Eppen‐dorff）；Icycler IQ 实时荧光定量PCR 仪、GelDoc 型电泳凝胶成像分析仪和DDY-10 型电泳仪（Bio-Rad）；IX53+DP73 倒置显微镜（Olympus）；AU680 全自动生化仪（Beckman）。

2 方法

2.1 药物制备 称取233、466 和932 mg 姜黄素，分别加入17.5 mL 纯净水搅拌混匀，并陶瓷研钵搅拌研磨混匀为混悬液，4 ℃冰箱保存，每周制备1次。

2.2 动物分组与模型建立 按雌雄比例为2∶1分笼饲养繁殖，取繁殖雄性幼鼠40只，出生后第14天一次性腹腔注射DEN（25 mg/kg），第4 周将小鼠断乳饲养并随机分为模型组和药物组（低、中、高剂量分别为100、200和400 mg/kg），每组10只。另取同龄雄性小鼠10只作为正常对照。从第8周开始，模型组和药物组灌胃给予CCl4（0.5 mL/kg），每周2 次；药物组以灌胃方式给予不同剂量姜黄素，每天1次（10 mL/kg）。

2.3 标本采集 第22 周末次给药后小鼠禁食不禁水，24 h 后称重，2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠后眼球取血，1 000×g离心15 min，分离血清−80 ℃保存，切取肝左叶部分组织用10%福尔马林固定，其余肝脏组织−80 ℃保存备用。

2.4 肝脏组织巨检 小鼠肝脏取出后生理盐水洗净拍照，观察小鼠肝脏表面，比较各组癌结节数量。

2.5 肝脏组织病理学观察 福尔马林固定48 h 后，常规石蜡包埋切片和HE 染色，光镜下观察并拍照，观察小鼠肝脏组织病变。

2.6 血清天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）活性的检测 采用全自动生化仪测定血清中AST和ALT活性，按试剂盒说明书操作。

2.7 RT-qPCR 检测HO-1 和NQO1 mRNA 表达 取相同部位肝脏组织约50 mg，加入1 mL Trizol UP 组织匀浆裂解，按照试剂盒说明书提取纯化RNA，逆转录为cDNA 后进行PCR 扩增，扩增条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。以β-actin 为内参照，采用2−ΔΔCt法计算HO-1 和NQO1 的mRNA 相对表达水平。NQO1 的上游引物序列为5´-GCA GAT CCT GGA AGG ATG GA-3´，下游引物序列为5´-GGT TGT CAGC TGG AAT GGA C-3´；HO-1 的上游引物序列为5´-TGT CTG AGG CCT TGA AGG AG-3´，下游引物序列为5´-CAG GGC CGT GTA GAT ATG GT-3´；β-actin的上游引物序列为5´-GTG ACG TTG ACA TCC GTA AAG A-3´，下游引物序列为5´-GCC GGA CTC ATC GTA CTC C-3´。

2.8 Western blot 检测HO-1 和NQO1 蛋白表达取相同部位肝脏组织约100 mg，将肝组织置于冰冷的裂解液收集裂解物总蛋白，采用BCA 法测定蛋白含量，并定量为5 g/L，配置10% SDS-PAGE 凝胶，每个样本点样10 µL，分离组织总蛋白并转印至PVDF膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h 后，分别与HO-1、NQO1 和β-actin 抗体（1∶1 000）孵育过夜，次日用TBST 洗膜（每次15 min，洗3 次）后，再与辣根过氧化物酶偶联的Ⅱ抗（1∶2 000）反应，洗涤Ⅱ抗（每次15 min，洗3次），经凝胶成像系统曝光成像，ImageJ软件测定条带灰度值，计算目的蛋白与β-actin 条带灰度值之比，即为目的蛋白的相对表达量。

2.9 免疫组化检测Ki67 蛋白表达 取包埋组织切片，按照二步法免疫组织化学试剂盒说明进行操作。为定量分析Ki67 阳性细胞，每张染色切片在显微镜下随机取5 个视野拍照并计数阳性细胞，观察到呈现棕褐色的为Ki67 阳性细胞，采用阳性细胞数所占百分比来表示表达量。

3 统计学处理

用GraphPad Prism 7.03 软件进行统计。计量资料均以均数±标准差（mean±SD）表示。采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 小鼠一般情况比较

至实验结束，模型及药物干预组小鼠肝脏100%成瘤且均无中途死亡。实验中后期模型及药物干预组小鼠开始精神萎靡，进食减少，体重增加缓慢且小于正常对照组。与正常对照组比较，模型组小鼠体重及增重显著降低（P<0.01），与模型组比较，低、中、高剂量姜黄素组小鼠体重及增重均显著升高（P<0.01）；与正常对照组比较，模型组小鼠肝重及肝脏指数显著升高（P<0.01），与模型组比较，低、中、高剂量姜黄素组小鼠肝重及肝脏指数均无显著变化（P>0.05），见表1。

表1 小鼠体重、增重、肝重及肝脏指数的比较Table 1. Comparison of body weight， weight gain， liver weight and liver index of the mice （Mean±SD. n=10）

2 肝脏形态学变化

由图1 可见，正常组小鼠肝脏表明光滑、色泽红润、质地细腻，没有出现增生结节；模型组小鼠肝脏色泽暗淡，边缘不整齐，可见表面出现大小不一质地较硬的白色圆形癌结节，结节切面有坏死及出血；给予姜黄素后，小鼠肝脏也可见白色癌结节，但与模型组相比，癌结节数量及大小明显减小。

Figure 1. Macroscopic examination of mouse livers. A： control group； B： model group； C： curcumin（ 100 mg/kg） group； D： cur‐cumin（ 200 mg/kg） group； E： curcumin（ 400 mg/kg） group.图1 小鼠肝脏外观

3 肝脏癌结节数量

通过图片观察肝脏，以直径2 mm 和5 mm 为界，计数肝脏正反表面癌结节数量。由表2 可见，与模型组比较，给予姜黄素后小鼠肝脏癌结节总数及小于2 mm 癌结节数量均显著减少（P<0.05 或P<0.01），大于2 mm癌结节数量均无显著差异。

表2 小鼠肝脏癌结节数Table 2. The numbers of tumor nodules in mouse livers （Mean±SD. n=10）

4 血清ALT和AST活性

与正常对照组比较，模型组小鼠血清ALT 和AST 活性显著升高（P<0.01）；与模型组比较，低、中、高剂量姜黄素组小鼠血清ALT 活性无显著变化，而AST活性均显著降低（P<0.01），见表3。

表3 小鼠血清ALT和AST水平Table 3. The serum levels of ALT and AST in mice （U/L. Mean±SD. n=10）

5 肝组织病理学

HE 染色结果显示，正常对照组小鼠肝脏结构正常，肝细胞结构完整、清晰，肝索排列整齐；模型组肝小叶结构模糊，有多处坏死并伴有炎症细胞浸润，出现大量大小、形状不一不规则排列的细胞核；与模型组相比，各姜黄素组肝小叶结构紊乱和肝细胞变性程度明显减轻，肝癌细胞排列相对有序，见图2。

Figure 2. HE staining results of paraffin sections of the mouse liver（ scale bar=20 µm）. A： control group； B： model group； C： cur‐cumin（ 100 mg/kg） group； D： curcumin（ 200 mg/kg） group； E： curcumin（ 400 mg/kg） group.图2 小鼠肝脏石蜡切片HE染色结果

6 肝组织中HO-1和NQO1的mRNA表达水平

RT-PCR 检测结果显示，与正常对照组比较，模型组小鼠肝组织中HO-1和NQO1的mRNA表达水平均显著升高（P<0.05）；与模型组相比，中剂量姜黄素组小鼠肝组织中HO-1 的mRNA 表达水平显著降低（P<0.05），高剂量姜黄素组小鼠肝组织中NQO1 的mRNA表达水平显著降低（P<0.05），见图3。

Figure 3. The mRNA expression levels of HO-1（ A） and NQO1（ B） in mouse livers. Mean±SD. n=10. #P<0.05 vs control group； *P<0.05 vs model group.图3 小鼠肝脏HO-1和NQO1的mRNA表达水平

7 肝组织中HO-1和NQO1蛋白表达水平

Western blot实验结果显示，与正常对照组比较，模型组HO-1 和NQO1 蛋白表达水平均显著升高（P<0.01）；与模型组相比，中剂量姜黄素组小鼠肝组织中HO-1 和NQO1 蛋白表达水平均显著降低（P<0.05），高剂量姜黄素组小鼠肝组织中NQO1 蛋白表达水平显著降低（P<0.05），见图4。

Figure 4. The protein expression levels of HO-1 and NQO1 in mouse livers. Mean±SD. n=10. ##P<0.01 vs control group； *P<0.05 vs model group.图4 小鼠肝脏HO-1和NQO1蛋白表达水平

8 肝组织Ki67蛋白的免疫组化染色

免疫组化染色结果（图5）显示，正常对照组、模型组、低剂量姜黄素组、中剂量姜黄素组和高剂量姜黄素组小鼠肝组织中Ki67阳性表达率分别为（1.55±0.05）%、（63.24±5.42）%、（38.32±2.98）%、（40.68±3.52）%和（35.46±3.79）%。低、中、高剂量组小鼠肝脏组织中Ki67 阳性表达率均低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05），给药组之间比较差异无统计学意义（P>0.05）。

Figure 5. Immunohistochemical staining of Ki67 in mouse livers（ scale bar=50 µm）. A： control group； B： model group； C： curcumin（100 mg/kg） group； D： curcumin（ 200 mg/kg） group； E： curcumin（ 400 mg/kg） group.图5 小鼠肝脏Ki67免疫组化染色

讨 论

本研究使用DEN 联合CCl4诱发的肝癌模型，100%的小鼠在5 个月大时出现肝脏肿瘤，且对肝脏致癌有较好的专一性。肝脏是药物代谢的主要器官，DEN 具有较强的肝毒性，可诱导急性肝毒性和肝细胞DNA 损伤［8］，可诱导肝内炎症发生，损伤肝细胞，造成肝组织纤维化，继而发生肝细胞结节性增生及肝硬化，最后诱发肝癌。将DEN 与CCl4联合使用诱导肝癌，可缩短造模时间，降低小鼠死亡率，其病变过程与人类肝癌病程相似，因而被广泛用于肝癌的临床及基础研究中。

Ki67是恶性肿瘤细胞增殖的标志物，表达越高，说明肿瘤细胞处于快速分裂期，增殖快，恶性程度较高。血清ALT 和AST 水平是评价肝功能损害的重要指标。当肝功能损害发生时血清ALT 和AST 活性也会大幅升高。本研究结果提示DEN 联合CCl4可明显诱导小鼠肝癌的发生，给与姜黄素干预后，小鼠肝脏Ki67表达显著降低，同时血清AST 活性也显著降低，提示姜黄素对DEN 联合CCl4诱导的肝癌模型小鼠有保护作用。

大多数HCC在慢性肝脏炎症的背景下发展。氧化应激被认为在HCC 发展的发病机制中起主要作用［9-10］。Nrf2-Keap1信号通路被认为是细胞内最重要的抗氧化应激机制之一。当细胞受毒物刺激时，Nrf2从Keap1中解偶联进入细胞核内，通过调控下游抗氧化分子如HO-1、NQO1 等的表达，从而抵抗氧化应激损伤［11-13］。本研究显示DEN 联合CCl4诱导小鼠肝癌形成，小鼠机体快速启动氧化应激形成自我保护，导致模型组小鼠肝脏HO-1 和NQO1 蛋白表达大幅度增加，但HO-1 和NQO1 过度表达将产生过多的Fe2+和CO，过多的Fe2+和CO 会一定程度地加大细胞氧化应激压力，损伤线粒体［14］，破坏细胞完整性［15］，因此过度表达的HO-1 和NQO1 反而有细胞毒性作用。而给予姜黄素后，小鼠肝脏HO-1 和NQO1 蛋白表达较模型组显著降低，将细胞内HO-1 和NQO1 蛋白表达控制在一定范围内，保障了Nrf2-Keap1 信号通路更好地发挥抗氧化应激的作用，因此姜黄素对于肝癌小鼠Nrf2-Keap1 信号通路平衡的调节值得进一步研究。