敲减SMARCA4通过抑制胆固醇合成导致HT1080细胞铁死亡*

张戎金蕾， 邱泽宇， 葛远龙，3， 鞠振宇， 伍 姝△

（1暨南大学教育部再生医学重点实验室，衰老与再生医学研究院，生命科学与技术学院，广东 广州 510632；2香港大学李嘉诚医学院生物医学学院，香港 999077；3暨南大学暨赛国际-暨南大学联合研发中心，广东 广州 510632）

哺乳动物交配型转换/蔗糖不发酵（mammalian SWItch/sucrose non-fermentable， mSWI/SNF）染色质重塑复合物通过ATP 酶（ATPase）亚基水解ATP 供能，重塑染色质结构，调控细胞功能，如细胞增殖、分化等。目前报道了29 个编码mSWI/SNF 复合物亚基的基因，不同的亚基可以组成不同亚型的mSWI/SNF复合物，介导不同的生理学功能。肿瘤中mSWI/SNF的基因突变率较高，且部分基因突变导致复合物功能改变并影响肿瘤的发生发展［1］。多项研究证明，该复合物的多种亚基，尤其是重要的ATPase 亚基SMARCA4 （SWI/SNF-related， matrix-associated， ac‐tin-dependent regulator of chromatin， subfamily A，member 4），在肿瘤发生发展中发挥作用，如卵巢癌等肿瘤中存在SMARCA4、ACTL6A（actin-like 6A）等编码mSWI/SNF 复合物亚基的基因表达上调［2-3］。因此，mSWI/SNF 也被认为是肿瘤治疗靶点之一［4］。针对mSWI/SNF ATPase 亚基的抑制剂被陆续报道［5-8］，且被认为主要通过抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡达到抑制肿瘤的效果［5，9-10］。

铁死亡是一种铁依赖性脂质过氧化物积累导致的细胞死亡［11-12］，由膜上过氧化磷酸甘油酯的过度积累诱导。由于部分肿瘤细胞的铁死亡敏感性高于正常组织，诱导肿瘤细胞发生铁死亡是肿瘤治疗的重要手段。亚铁离子依赖的芬顿链式反应使多不饱和脂酰磷酸甘油酯过氧化是过氧化磷酸甘油酯积累的主要途径［13］，胱氨酸/谷氨酸逆向转运系统/谷胱甘肽过氧化酶（glutathione peroxidase 4， GPX4）轴或合成泛醌醇（ubiquinol， CoQH2）是清除过氧化磷酸甘油酯的主要途径［14］。胆固醇（cholesterol， Chol）处理也能通过降低细胞膜流动性抑制过氧化磷酸甘油酯扩散和进一步积累［15］。

此外，mSWI/SNF 复合物也影响胆固醇代谢。研究表明，SMARCA4基因第30 内含子上的rs1122608 G/T与血浆胆固醇水平和心肌梗死风险有相关性［16］。mSWI/SNF 复合物的核心亚基SMARCB1通过调控乙酰化水平影响胆固醇稳态［17］。肝脏SWI/SNF 的BAF60a 亚基也在全身胆固醇稳态维持方面发挥功能［18］。

虽然部分文献报道了铁死亡与mSWI/SNF 复合物的相关性，但是两者的具体关系仍不够清晰。人纤维肉瘤HT1080细胞常用于铁死亡机制的研究，且其编码mSWI/SNF 复合物亚基的基因不存在基因突变。因此，本项工作旨在利用HT1080 细胞研究SMARCA4 对铁死亡的影响，从而为铁死亡机制的研究提供参考。

材料和方法

1 细胞

人纤维肉瘤细胞系HT1080 来自中国典型培养物保藏中心（China Center for Type Culture Collec‐tion， CCTCC）。

2 主要的仪器和试剂

QuantStudio™ 6 实时荧光定量PCR 系统（Thermo Fisher）；高内涵共聚焦成像系统（ImageXpress®Mi‐cro Confocal system； Molecular Devices）；LSRFortessa流式细胞分析仪（BD）。

DMEM 培养液（C11995500BT）购自Gibco；Lipo‐fectamine™ RNAiMAX（13778030）和脂质过氧化探针BODIPY ™ 581/591 C11（D3861）购 自Thermo Fisher Scientific；RNAiso Plus（108-59-2）购自TaKaRa；逆转录试剂盒（R323-01）购自南京诺唯赞公司；铁死亡诱导剂Ras 选择性致死小分子3（Ras-selective lethal small molecule 3， RSL3； S8155）、广谱caspase 抑制剂/凋亡阻断剂N-苯甲基氧化碳酰-缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-氯化丙酮［Z-VAD（OMe）-FMK， Z-VAD；S7023］、铁死亡抑制剂铁抑素1（ferrostatin-1， Fer-1；S7243）和坏死性凋亡抑制剂坏死抑素2 外消旋体（necrostastin 2 racemate， Nec-1s； S8641）购自Selleck；碘化丙啶（propidium iodide， PI； A601112）、2´-［4-乙氧基苯基］-5-［4-甲基-1-哌嗪基］-2，5´-二苯并咪唑三盐酸化物三水合物（2´-［4-ethoxyphenyl］-5-［4-methyl-1-piperazinyl］-2，5´-bi-1H-benzimidazole trihydrochlo‐ride trihydrate， Hoechst 33342； E607328）和钙黄绿素乙酰甲酯（calcein acetoxymethyl ester， calcein AM；A602198）购自上海生工生物工程有限公司；qPCR 反应Mix（A301-10）从北京康润诚业生物科技有限公司采购；还原型谷胱甘肽（glutathione， GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG）检测试剂盒（S0053）和DCFH-DA（S0033S）购自上海碧云天生物技术有限公司；SMARCA4 抗体（21634-1-AP）购自武汉三鹰生物技术有限公司；鼠Ⅱ抗（7074）和兔Ⅱ抗（7076）购自Cell Signaling Technology；β-actin 抗体（AC026）从武汉爱博泰克生物科技有限公司采购；胎牛血清（FSP500）从依科赛生物科技（太仓）有限公司采购；其他生化试剂均为进口分装；引物由北京擎科生物科技股份有限公司根据设计合成；siRNA 由苏州吉玛生物科技有限公司设计合成。

3 方法

3.1 细胞培养 HT1080 细胞培养于37 ℃、5% CO2培养箱中，培养液为添加了10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM高糖培养液。

3.2 RNAi 技术 依照Lipofectamine™ RNAiMAX 说明书敲减SMARCA4基因。

3.3 程序性细胞死亡类型的检测 参考已发表的实验方法［11］：将转染后48 h 的细胞分为4 组，分别换为含1% DMSO、50 µmol/L Z-VAD、50 µmol/L Nec-1s和2 µmol/L Fer-1 的培养液，孵育过夜。利用高内涵细胞成像分析系统检测各组细胞死亡率。

3.4 含胆固醇培养液的配制 参考前人已发表的实验方法［19］：按1∶100 比例溶解将胆固醇晶体溶解于无水乙醇。将溶解胆固醇的乙醇溶液以胆固醇∶甲基-β-环糊精（methyl-β-cyclodextrin， MβCD）为1∶8的比例加入已溶解MβCD 的DMEM 高糖培养液。用0.22 µm 滤膜过滤后添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素。

3.5 高内涵细胞成像分析系统检测细胞死亡率待测孔板中加入PI 和Hoechst 33342，使其终浓度分别为1 g/L 和2 g/L，37 ℃孵育20 min。每孔分别利用高内涵共聚焦成像系统的全自动高速显微成像模块在选定的四个视野中拍摄，利用全自动图像分析模块分别统计PI 和Hoechst 33342 的阳性细胞数，通过下述公式计算细胞死亡率。细胞死亡率（%）=PI 阳性细胞数/Hoechst 33342阳性细胞数×100%。

3.6 流式细胞术检测细胞脂质过氧化水平、总活性氧（reactive oxygen species， ROS）水平和不稳定铁池（labile iron pool， LIP）水平 收集细胞，分别依照脂质过氧化探针（BODIPY™ 581/591 C11）、总ROS 探针（DCFH-DA）和LIP 水平探针（calcein AM）说明书染色后，利用流式细胞仪检测相应指标。

3.7 细胞GSH和GSSG水平的检测 收集细胞后按照GSH 和GSSG 检测试剂盒说明书检测GSH 和GSSG 水平，以蛋白浓度均一化后得到样品的GSH 和GSSG水平。

3.8 基因转录水平变化的检测 依照RNAiso Plus说明书提取各组细胞总RNA；再利用逆转录试剂盒去除基因组DNA（genomic DNA， gDNA）后逆转录；最后依照qPCR 反应预混合溶液说明书，利用实时荧光定量PCR系统上机检测。引物序列见表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

3.9 Western blot 利用适量含十二烷基硫酸钠的上样缓冲液裂解样品，沸水浴10 min 后用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，再将蛋白转到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride， PVDF）膜上。PVDF 膜封闭后依次孵育相应Ⅰ抗和Ⅱ抗，再在凝胶成像系统中进行化学发光成像。采用ImageJ 软件对条带进行定量分析。

3.10 转录组数据分析 我们分析了GSE229452［20］数据集中mSWI/SNF ATPase 抑制剂AU-15330 处理后弥漫性内在脑桥胶质瘤（diffuse intrinsic pontine gliomas， DIPGs）细胞的转录组变化和GSE102560［21］数据集中敲减SMARCA4后人肝癌细胞（HepG2）的转录组变化：通过DESeq2 包分析GSE229452 的表达差异，筛选两个数据集中同时满足|log2（fold change）|≥1和P<0.01 的基因，分别作为相应处理的差异基因。先利用VennDiagram 包绘制差异基因的交集，再利用clusterProfiler 包对表达变化趋势相同的差异基因进行基因本体论（gene ontology， GO）功能富集分析。

4 统计学处理

本研究的统计学分析是基于Graphpad Prism 8软件进行的。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。除转录组数据外其他数据n≥3，数据用均数±标准差（mean±SD）表示，P<0.05则认为差异有统计学意义。图片绘制和处理采用Graphpad Prism 8 软件、MetaXpress 6 软件、ImageJ 2 软 件、Adobe Illustrat 2023 软件、VennDiagram 包、clusterProfiler包、ggplot2包和FlowJo 10软件。

结 果

1 RSL3 处理降低mSWI/SNF 复合物ATPase 亚基的蛋白水平

铁死亡诱导剂RSL3 处理显著诱导HT1080 细胞死亡（P<0.05 或P<0.01；图1A），也能显著下调细胞中SMARCA4蛋白水平（P<0.05或P<0.01；图1B）。

Figure 1. Treatment with RSL3 reduced the protein level of mSWI/SNF ATPase subunit SMARCA4 in HT1080 cells. A： representa‐tive images of HT1080 cells treated with ferroptosis inducer RSL3 for 8 h at the indicated concentrations （scale bar=100µm； blue： live cells stained with Hochest； fuchsia： death cells stained with Hochest and PI）， and cell viability quantified using high-content analysis； B： the SMRACA4 protein level in HT1080 cells treated with RSL3 at the indicated concentra‐tions for 8 h was detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs DMSO group.图1 RSL3处理降低mSWI/SNF ATPase亚基SMARCA4的蛋白水平

2 敲减SMARCA4基因导致细胞铁死亡

敲减SMARCA4基因导致的细胞死亡能被铁死亡抑制剂Fer-1 和凋亡抑制剂Z-VAD 处理显著挽救（P<0.01），见图2。

Figure 2. Ferroptosis inhibitor rescued HT1080 cell death caused by SMARCA4 knockdown. After knockdown of SMARCA4， HT1080 cells were treated overnight with reprogrammed cell death inhibitor（ Z-VAD， Nec-1s or Fer-1） or DMSO. A： merged repre‐sentative images of HT1080 cells（ scale bar=100 µm； blue： live cells stained with Hochest； fuchsia： death cells stained with Hochest and PI）， and cell mortality quantified using high-content analysis； B： the SMRACA4 protein level in HT1080 cells was detected by Western blot. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NC group； △△P<0.01 vs DMSO group.图2 铁死亡抑制剂挽救敲减SMARCA4导致的死亡

敲减SMARCA4基因可显著提高脂质过氧化和总ROS 水平（P<0.01；图3A、B），且显著增加前列腺素内过氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）基因的转录（P<0.05；图3C）。

Figure 3. Knockdown of SMARCA4 affected ferroptosis markers. A： the HT1080 cells were treated with BODIPY ™ 581/591 C11（C11-Bodipy） dye at a final concentration of 5 µmol/L， and the relative mean fluorescence intensity（ MFI） of lipid reactive oxygen species（ROS） was quantified by flow cytometry； B： the HT1080 cells were treated with DCFH-DA dye at a final concentration of 10 µmol/L， and the relative MFI of total ROS was quantified by flow cytometry； C： relative mRNA expres‐sion level of prostaglandin-endoperoxide synthase 2（ PTGS2） in HT1080 cells was measured by RT-qPCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs negative control（ NC） group.图3 敲减SMARCA4影响铁死亡指标

3 敲减SMARCA4基因不通过影响LIP导致铁死亡

我们检测了敲减SMARCA4基因后LIP 重要调节基因的转录水平，结果显示，敲减SMARCA4基因显著降低铁死亡促进基因NCOA4的转录水平，此外，siSMARCA4-1 组的铁死亡促进基因ATG7和铁死亡抑制基因FTH1的转录水平也显著增加（P<0.05），见图4A、B。敲减SMARCA4基因显著增加calcein AM探针标记的细胞的荧光强度（P<0.01），见图4C。

Figure 4. Knockdown of SMARCA4 did not induce ferroptosis by the labile iron pool （LIP）. A： relative mRNA expression levels of TFR1， KEAP1， ATG5， ATG7 and NCOA4 in negative control （NC） and SMARCA4 knockdown HT1080 cells were mea‐sured by RT-qPCR； B： relative mRNA expression levels of FTL， FTH1， HSPB1， IREB2 and NRF2 in NC and SMARCA4 knockdown HT1080 cells were measured by RT-qPCR； C： the HT1080 cells were stained with calcein AM dye at 0.25µmol/L， and the relative MFI， which is negative correlated with the LIP level， was measured by flow cytometry. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs NC group.图4 敲减SMARCA4不通过LIP导致铁死亡

4 敲减SMARCA4 基因不通过影响调控铁死亡的ROS调节基因的转录水平导致铁死亡

敲减SMARCA4基因不影响ACSL4和LPCAT3这两个合成多不饱和脂酰磷酸甘油酯的关键基因（P<0.05）；敲减SMARCA4显著增加SAT1基因的转录水平（P<0.05），但是没有明显影响其下游ALOX15基因的转录水平（P>0.05），见图5A。敲减SMARCA4基因对GSS和GPX4基因的转录水平没有显著影响（P>0.05），siSMARCA4-1 和siSMARCA4-2 组在SLC7A11基因上的结果不一致，见图5B。仅siSMARCA4-1 组的GSH 水平显著下降（P<0.05），见图5C。敲减SMARCA4基因显著提高GCH1基因的转录水平（P<0.05），但不影响DHODH和FSP1基因的转录水平（P>0.05），见图5D。

Figure 5. Knockdown of SMARCA4 did not induce ferroptosis by affecting the transcription levels of ferroptosis-associated reactive oxygen species（ROS） regulatory genes. A： relative mRNA expression levels of ACSL4， LPCAT3， SAT1 and ALOX15 in negative control（ NC） and SMARCA4 knockdown HT1080 cells were measured by RT-qPCR； B： relative mRNA expression levels of SLC7A11， GSS and GPX4 in NC and SMARCA4 knockdown HT1080 cells were measured by RT-qPCR； C： rela‐tive GSH level in NC and SMARCA4 knockdown HT1080 cells； D： relative mRNA expression levels of GCH1， DHODH and FSP1 in NC and SMARCA4 knockdown HT1080 cells were measured by RT-qPCR. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs NC group.图5 敲减SMARCA4不通过影响调控铁死亡的活性氧调节基因的转录水平而导致铁死亡

5 敲减SMARCA4 基因通过抑制胆固醇合成导致铁死亡

在GSE102560 数据集中，敲减SMARCA4后HepG2 细胞中有1 716 个差异基因；在GSE229452 数据集中，SWI/SNF ATPase 亚基降解剂AU-15330 处理后DIPGs 细胞中有2 118 个差异基因；两个数据集有360 个共同差异基因（图6A），且其中有95 个共同下调基因（图6B），83个共同上调基因（图6C）。两个数据集中共同下调的差异基因主要富集在细胞组分（cell component， CC）这一类别体系中，且脂筏相关通路（脂筏与膜微结构）的评分较高（图6D）。我们的结果也显示，胆固醇合成的重要基因有下降的趋势（图6E）。敲减SMARCA4基因显著降低SQLE和HMGCR基因这两个关键的胆固醇合成限速酶基因的转录水平（P<0.05），见图6F。此外，胆固醇处理能显著抑制敲减SMARCA4基因导致的细胞死亡率增加（P<0.01），见图6G。

Figure 6. Knockdown of SMARCA4 caused cell ferroptosis by inhibiting cholesterol synthesis. A： Venn diagram of common differen‐tially expressed genes（ DEGs） from GSE229652 and GSE102560； B： Venn diagram of down-regulated common DEGs from GSE229652 and GSE102560； C： Venn diagram of up-regulated common DEGs from GSE229652 and GSE102560； D： dot plot showed the result of gene ontology （GO） enrichment analysis for down-regulated common DEGs between SMARCA4 knockdown group and control group； E： the expression levels of genes involved in cholesterol synthesis in GSE229652 and GSE102560； F： relative mRNA expression levels of SQLE and HMGCR in NC and SMARCA4 knockdown HT1080 cells were measured by RT-qPCR； G： merged representative images of HT1080 cells treated with Fer-1， cholesterol or DMSO af‐ter knockdown of SMARCA4（scale bar=100 µm； blue： live cells stained with Hochest； fuchsia： death cells stained with Hochest and PI）， and cell mortality quantified using high-content analysis. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs NC group； △△P<0.01 vs DMSO group.图6 敲减SMARCA4通过抑制胆固醇合成导致铁死亡

讨 论

mSWI/SNF 与肿瘤治疗的关系较为复杂：一方面，由于在滑膜肉瘤、一些淋巴和恶性肿瘤中存在mSWI/SNF 复合物亚基的失活突变，mSWI/SNF 被认为具有抑癌作用［1］；但另一方面，mSWI/SNF 复合物也是多种恶性肿瘤，如血液恶性肿瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、小细胞前列腺癌、乳腺癌和滑膜肉瘤等细胞存活所必须的［1，22-24］，被认为是肿瘤治疗的靶标。研究抑制mSWI/SNF 对肿瘤细胞的杀伤效果与机制可以为该复合物抑制剂的肿瘤治疗效果提供佐证。已有研究认为抑制mSWI/SNF ATPase 亚基通过抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡达到抑制肿瘤的效果［1，7］。

本研究显示，mSWI/SNF 复合物的核心ATPase亚基SMARCA4 可能通过影响细胞内胆固醇水平调节HT1080细胞的铁死亡。这表明SMARCA4是杀伤HT1080 细胞的靶标，对研究mSWI/SNF 与铁死亡的关系有着重要的启示作用。此外，铁死亡诱导剂RSL3处理后SMARCA4蛋白水平显著降低（图1），提示RSL3 不止通过靶向GPX4 蛋白诱导铁死亡，也通过抑制SMARCA4 蛋白诱导铁死亡。我们还发现敲减SMARCA4基因使细胞内LIP 显著缩小（图4C），且显著提高GCH1基因的转录水平（图5D），这提示敲减SMARCA4基因后细胞可能存在降低铁蛋白自噬和提高GCH1基因转录水平的反馈调节机制。

此外，SMARCA4 亚基被报道调控细胞的胆固醇摄取和机体的胆固醇稳态。细胞通过低密度脂蛋白受体（low-density lipoprotein receptor， LDLR）吸收胆固醇。SMARCA4-LDLR基因座位于第19号染色体13区，该基因座的多个单核苷酸多态性都被认为是影响血浆胆固醇水平的遗传因素［25-26］。我们的结果显示，敲减SMARCA4基因通过抑制胆固醇合成导致铁死亡（图6）。

铁死亡往往伴随着细胞外基质组分的变化，例如，RSL3处理后。人皮质/近曲小管细胞（HK2细胞）分泌多种纤维化因子并发生铁死亡［27］；软骨细胞铁死亡时II 型胶原的表达水平降低［28］。已有多篇报道表明mSWI/SNF 复合物影响细胞外基质［29］。例如，SMARCA4 会影响黑色素瘤胞外基质成分，在黑色素瘤转移中起重要作用［29］；mSWI/SNF 结构的破坏会导致整合素、钙黏蛋白和关键间充质调节因子的表观遗传学抑制，并抑制对肿瘤对细胞外基质的黏附和侵袭能力［30］。我们的数据也表明，抑制SMARCA4亚基影响细胞外基质相关的通路（如细胞外结构、细胞外基质、含有胶原的细胞外基质和胶原三聚体；图6D）。这提示SMARCA4 亚基是铁死亡影响细胞外基质的潜在途径之一。

综上所述，RSL3 处理降低mSWI/SNF 复合物核心ATPase 亚基SMARCA4 蛋白水平；敲减SMARCA4基因通过抑制胆固醇合成导致铁死亡。本研究增进了对铁死亡机制的认识，也提示了染色质可及性变化对铁死亡的重要作用。