着丝粒蛋白H在肾上腺皮质癌的表达及对肾上腺皮质癌细胞活力和迁移的影响*

邹存茹， 王 丹， 张 玉， 刘呈悦， 蒋荷坪， 何文玺， 张鑫源， 苏文霞△

（1山东第二医科大学基础医学院，山东 潍坊 261053；2山东第二医科大学附属医院病理科，山东 潍坊 261031；3山东第二医科大学临床医学院，山东 潍坊 261053）

肾上腺皮质癌（adrenocortical carcinoma， ACC）是一种起源于肾上腺皮质的罕见恶性内分泌肿瘤，具有高度侵袭性。50%～60%的患者伴有类固醇激素分泌增加，表现为库欣综合征或男性化［1］。该病预后差，5 年总生存率约50%［2］。尽管ACC 是一种罕见肿瘤，发病率低，但由于疾病诊断时多为晚期，已出现远处转移，而且手术后容易复发，因此仍是一种严重威胁人们健康的恶性肿瘤。

着丝粒蛋白（centromere protein， CENP）是在细胞分裂过程中起重要作用的一组蛋白。在细胞有丝分裂和减数分裂过程中，CENP 衔接染色体与纺锤体微管的结合，进而调控姐妹染色单体的准确分离，保证细胞的精确复制［3］。CENP 表达异常或功能缺损会造成染色体丢失、易位，导致细胞核型异常和染色体不稳定，从而使细胞生长失控，促进肿瘤的产生与发展［4-5］。

CENP-H 是CENP 家族的重要的成员之一，是活性着丝粒复合体的重要组成部分，与CENP-A 和CENP-C 一起定位于内板，负责将着丝粒与纺锤体微管连接起来［6-7］。近年来研究发现，CENP-H 在肿瘤中高表达，并与疾病进展和预后显著相关，靶向沉默CENP-H导致肿瘤细胞的凋亡和增殖抑制［8-13］。然而，目前CENP-H 在ACC 的表达水平、与疾病进展和预后的关系以及沉默CENP-H对ACC 细胞活力和迁移的影响尚不清楚，本文旨在研究这些问题。

材料和方法

1 主要材料

胎牛血清购自HyClone；siRNA 及细胞转染试剂购自广州锐博生物技术有限公司；兔抗人CENP-H单克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；兔抗人GAPDH、p-ERK1/2、t-ERK1/2、p-P38、t-P38、p-JNK1/2 和t-JNK1/2 单克隆抗体购自Cell Signaling Technology。

2 主要方法

2.1 GEPIA2 数据库 运用GEPIA2 数据库（http：//gepia2. cancer-pku. cn/）［14］，分 析CENP-H 在76 例ACC患者和128例健康对照中的mRNA表达水平，分析其在不同TNM 分期ACC 患者中的表达，并进一步分析其与ACC患者总体生存率（overall survival）之间的相关性。

2.2 UALCAN 数据库 应用UALCAN 数据库（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）［15］中的数据分析CENP-H 在不同TNM 分期ACC 患者的表达和预后。

2.3 免疫组织化学染色 4 例ACC 和4 例正常肾上腺石蜡组织切片脱蜡，柠檬酸钠沸液中抗原修复10 min，加入3%过氧化氢室温孵育12 min，5%牛血清白蛋白封闭35 min，倒出封闭液后加入兔抗人CENP-H 单克隆抗体（1∶100 稀释），4 ℃孵育过夜。加入Ⅱ抗室温孵育1 h，显微镜下观察二氨基联苯胺显色情况。苏木精复染，分化、脱水、封片，采用综合计分法进行半定量分析。

2.4 细胞培养及转染 人ACC 细胞系H295R 用含10%胎牛血清和1% Gibco™ Insulin-Transferrin-Sele‐nium （ITS-G）的DMEM/F12 培养液，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度下培养。将对数生长期的H295R细胞调整密度为1×105/mL，取2 mL 种于六孔板内，待细胞融合度为30%～50%时，用转染试剂将终浓度为50 nmol/L 的CENP-HsiRNA （siCENP-H）转染细胞，放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养。细胞分为si‐CENP-H 组和阴性对照（siNC）组。siCENP-H 的序列为5´-AACAAUUUCCUUAAGGGCAGGAUCC-3´；siNC的序列为5´-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3´。

2.5 CCK-8 实验 将对数生长期的H295R 细胞种于96孔板内，每孔5 000个，siRNA 转染细胞（方法同前），于0、24、48、72 和96 h 检测细胞活力。收获前2 h，每孔加入10 µL CCK-8 溶液（5 g/L）继续培养。置于摇床上低速振荡10 min，在酶联免疫检测仪570 nm波长处测量各孔的吸光度（A）。每组设3个复孔，实验重复3次。

2.6 划痕实验 收集转染后72 h 实验组和对照组细胞，调整细胞密度为2×105/mL，取2 mL 种于6 孔板内，待细胞融合度为70%～80%时进行划痕并更换培养液，用含1%胎牛血清和1% ITS-G的DMEM/F12培养液，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度下继续培养，于0、24、48和72 h观察细胞迁移情况并拍照记录。

2.7 Western blot实验 收获转染后72 h细胞，提取细胞总蛋白；经10% SDS-PAGE 分离蛋白，转膜，封闭；加入Ⅰ抗（GAPDH 和CENP-H 抗体，1∶1 000；p-ERK1/2、t-ERK1/2、p-P38、t-P38、p-JNK1/2 和t-JNK1/2 抗体，1∶2 000），4 ℃孵育过夜；孵育辣根过氧化物酶标记的羊抗兔Ⅱ抗（1∶5 000）；ECL 化学发光法检测蛋白的表达，扫描后用Gel-Pro Analyzer 软件进行灰度分析，计算目的蛋白与内参照条带灰度的比值，以及磷酸化MAPK 与总MAPK 条带灰度的比值。实验重复3次。

3 统计学处理

GEPIA2 数据库和UALCAN 数据库中导出的箱线图、小提琴图及生存曲线采用数据库网站中的统计分析方法，其中箱线图数据的表达格式为中位数。使用SPSS 18.0软件对实验结果进行分析，实验数据采用均数±标准差（mean±SD）表示，两组定量资料比较采用独立样本t检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 CENP-H mRNA 在ACC 中高表达且随肿瘤分期表达升高

GEPIA2 数据库 分 析了CENP-H 在76 例ACC 患者和128 例健康对照中RNA 测序（RNA-seq）数据的差异（以TPM值衡量mRNA表达水平），发现CENP-H在ACC 中高表达（P<0.05），见图1A、B。GEPIA2 数据库进一步检测了CENP-H 在肿瘤不同TNM 分期患者中的表达，通过方差分析，发现CENP-H 在I、II、III和IV 期ACC 患者的表达存在显著差异（F=5.82，P<0.01），见图1C。UALCAN 数据库显示，CENP-H 在IV 期ACC 的表达显著高于I、II 和III 期（P<0.05），见图1D。以上结果表明，CENP-H mRNA 在ACC 中高表达且随肿瘤分期表达升高。

Figure 1. The mRNA expression of CENP-H in adrenocortical carcinoma （ACC）. A and B： the mRNA expression of CENP-H in ACC patients（ n=77） and normal controls（ n=128） from GEPIA2 database； C： violin plots of CENP-H mRNA in different TNM stages of ACC patients from GEPIA2 database； D： the mRNA expression levels of CENP-H in different TNM stages of ACC patients from UALCAN database. TPM： transcripts per million. *P<0.05 vs normal； #P<0.05， ##P<0.01 vs stage IV.图1 在ACC中CENP-H的mRNA表达

2 CENP-H高表达与ACC患者不良预后相关

GEPIA2数据库分析了CENP-H的mRNA 表达与ACC 患者总体生存率之间的相关性。CENP-H 高表达组患者的总体生存率明显低于低表达组（HR=4，P<0.01），见图2A。UALCAN数据库也显示，与CENPH 低表达组相比，CENP-H 高表达组患者的总体生存率显著降低（P<0.000 1），见图2B。以上结果表明，CENP-H高表达与ACC患者不良预后相关。

Figure 2. Correlation of between CENP-H expression and prognosis of adrenocortical carcinoma（ ACC） patients. A： impact of CENPH expression on the overall survival of ACC patients in GEPIA2 database（ n=38）； B： impact of CENP-H expression on the survival probability of ACC patients in UALCAN database.图2 CENP-H表达与ACC预后的相关性

3 CENP-H 蛋白在ACC 组织的表达水平高于正常肾上腺

CENP-H 为核内蛋白，在4 例ACC 组织的阳性率为（4.7±0.5）%，在4例正常肾上腺的阳性率为（0.9±0.2）%，差异有统计学意义（P<0.01），见图3。这表明CENP-H 蛋白在ACC 组织的表达水平高于正常肾上腺。

Figure 3. The expression of CENP-H protein in adrenocortical carcinoma（ ACC） tissues. Immunohistochemical staining of paraffinembedded ACC and normal adrenal gland specimens was performed. Scale bar=20 µm. Red arrows indicate CENP-H posi‐tive cells. Mean±SD. n=4. **P<0.01 vs normal group.图3 CENP-H蛋白在ACC石蜡切片的表达

4 敲减CENP-H表达抑制H295R细胞活力和迁移

H295R细胞转染siCENP-H后CENP-H蛋白表达水平显著下降（P<0.01），表明成功敲减H295R 细胞中CENP-H表达，见图4。转染siCENP-H 后24 h，H295R 细胞活力较对照组显著降低，随着时间延长，在转染后48、72 和96 h，与对照组的差距逐渐加大（均P<0.01），见图5A。siCENP-H 组H295R 细胞的迁移率也较siNC 组显著降低，随着时间延长两组的差距逐渐增大（均P<0.01），见图5B。以上结果表明，敲减CENP-H表达可以抑制H295R 细胞活力和迁移能力。

Figure 4. The expression of CENP-H protein in H295R cells transfected with siCENP-H. Mean±SD. n=6. **P<0.01 vs siNC group.图4 H295R细胞转染siCENP-H后CENP-H蛋白的表达

Figure 5. Impact of CENP-H knockdown on the viability （A； CCK-8 assay） and migration （B； wound-healing assay） of H295R cells. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs siNC group.图5 敲减CENP-H表达对H295R细胞活力和迁移的影响

5 敲减CENP-H表达抑制MAPK信号通路的活化

H295R 细胞转染siCENP-H 后72 h，p-ERK1/2 与t-ERK1/2 的比值在siNC 组为0.64±0.13，在siCENPH 组为0.88±0.57，差异无统计学意义（P=0.05）；p-P38 与t-P38 的比值在siNC 组 为0.90±0.02，在si‐CENP-H 组为0.75±0.06，siCENP-H 组显著低于siNC组（P=0.02）；p-JNK1 与t-JNK1 的比值在siNC 组为0.92±0.04，在siCENP-H 组为0.52±0.20，siCENP-H组显著低于siNC 组（P=0.03）；p-JNK2与t-JNK2的比值在siNC 组为0.81±0.17，在siCENP-H 组为0.36±0.16，siCENP-H 组显著低于siNC 组（P=0.03），见图6。这表明敲减CENP-H表达抑制P38 和JNK 信号通路的活化，其中抑制JNK 信号通路活化的效应尤为显著。

Figure 6. Impact of CENP-H knockdown on the activation of MAPK signaling pathways in H295R cells. The protein levels of p-ERK1/2， t-ERK1/2， p-P38， t-P38， p-JNK1/2 and t-JNK1/2 were detected by Western blot. Mean±SD. n=6. *P<0.05 vs siNC group.图6 敲减CENP-H表达对H295R细胞中MAPK信号通路的影响

讨 论

已有研究发现CENP-H 在鼻咽癌、舌癌、非小细胞肺癌、食管癌和肝癌中高表达，且肿瘤体积越大、病理分级分期越高CENP-H 的表达也越高，CENP-H高表达的患者较低表达患者总体生存率降低。CENP-H是评估鼻咽癌、舌癌、非小细胞肺癌、食管癌和肝癌预后的独立标志物［8-12］。我们研究发现ACC患者中CENP-H 的mRNA 和蛋白表达均高于健康对照，CENP-H mRNA随肿瘤分期表达升高，CENP-H高表达患者的总体生存率明显低于低表达患者，提示CENP-H 高表达与ACC 患者不良预后相关，CENP-H是评估ACC患者预后的可靠标志物。

CENP-H 在发生远处转移的IV 期ACC 患者表达水平较肿瘤局限在肾上腺的I 期、II 期和近处转移的III 期患者明显升高，且CENP-H 高表达患者的生存率显著降低，提示CENP-H 在ACC 肿瘤进展和转移中具有重要作用。在肝癌细胞中，敲减CENP-H导致了细胞增殖抑制和集落形成能力降低，并诱导了细胞凋亡［13］。那么，CENP-H 对ACC 细胞生物学功能具有怎样的影响呢？我们发现敲减ACC 细胞CENP-H的表达后细胞活力和迁移受到抑制，说明CENP-H 在增强ACC 细胞活力和促进细胞迁移中具有重要作用。

MAPK 信号通路是调控细胞生长、分化、发育、迁移等关键的信号通路。MAPK 分子包括ERK1/2、JNK1/2/3、P38 和ERK5，磷酸化的MAPK 分子具有活性，能够进一步激活与细胞生长、分化、发育、迁移等相关的转录因子，从而调控细胞生物学行为［16］。此外，MAPK 信号通路还参与了肿瘤的增殖和转移。在前列腺癌细胞中敲减DLL3的表达可导致p-ERK1/2、p-JNK1 和p-P38 蛋白水平下降，而过表达DLL3导致p-ERK1/2、p-JNK1 和p-P38 蛋白水平升高，DLL3通过MAPK 信号通路促进了前列腺癌的增殖、迁移和侵袭［17］。在肺癌细胞中敲减CENP-H表达可导致p-ERK1/2 和p-P38 蛋白水平下降，其中p-P38 蛋白的下降尤为明显，CENP-H通过ERK/P38信号通路调控肺癌的进展和顺铂耐药［18］。在本研究中，敲减ACC细胞CENP-H表达后p-ERK1/2 蛋白无明显变化，p-P38 和p-JNK1/2 蛋白水平降低，以p-JNK1/2 蛋白的降低尤为显著，表明敲减ACC 细胞CENP-H表达抑制了P38 和JNK 信号通路。在生理状态下，P38 和JNK 信号通路主要参与炎症、凋亡和应激反应［19］。P38 和JNK 信号通路根据细胞类型的不同可能发挥促进或抑制细胞增殖、分化、迁移等截然相反的生物学效应，而在肿瘤细胞中，两者可能通过促进炎症因子的释放促进肿瘤的发生［20］。P38δ缺失抑制了小鼠皮肤癌细胞的增殖，因而P38 信号通路在小鼠皮肤癌进展中具有重要作用［21］。我们的研究结果提示CENP-H 可能通过P38 和JNK 信号通路发挥调控ACC 细胞活力和迁移的作用，下一步需要在敲减CENP-H表达的同时加入P38 或JNK 激动剂检测细胞活力和迁移的改变，来明确CENP-H 是否经由P38和JNK信号通路影响ACC细胞活力和迁移。

综上所述，本研究通过分析ACC 患者和健康对照CENP-H mRNA 和蛋白水平的表达差异，发现CENP-H 在ACC 患者高表达。进一步的研究发现CENP-H mRNA 随肿瘤分期增加而表达升高，CENPH 高表达患者的总体生存率明显低于低表达患者。敲减ACC 细胞CENP-H表达，可减弱细胞活力，抑制细胞迁移，并抑制P38 和JNK 信号通路的活化。本研究为评估ACC患者的预后提供了可靠的生物标志物，并为ACC患者的治疗提供了潜在的靶点。