Ywhab通过靶向Hsp90aa1抑制小鼠B细胞淋巴瘤38B9细胞生长*

魏子辰， 张 毅▲， 许 晗▲， 王 鑫， 谷 婷， 庞 磊， 赵明超， 郁多男△

（1扬州大学医学院/江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室，江苏 扬州 225009；2扬州大学附属医院消化内科，江苏 扬州 225003）

弥漫性大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lym‐phoma， DLBCL）属于成熟B 细胞肿瘤［1］，是淋巴瘤最常见的亚型［2-3］。DLBCL 可根据基因表达模式分为生发中心B 细胞（germinal center B-cell， GCB）和活化B 细胞（activated B-cell， ABC）两种亚型［2］。尽管目前已有很多研究［4-5］，但其具体发病机制还不清楚。

人Ywhab（tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein beta）基因位于20号染色体上（20q13.12），其编码蛋白14-3-3β 是14-3-3 家族的重要成员。研究表明，Ywhab 在胶质瘤、乳腺癌和结直肠癌中高表达且与患者预后呈负相关［6-7］。然而，目前Ywhab 在淋巴瘤尤其是DLBCL 中的作用尚未有研究报道。本文就Ywhab 在小鼠B 细胞淋巴瘤38B9细胞中的作用及其机制进行研究。

材料和方法

1 动物及细胞

SPF 级雄性BALB/c 小鼠，8～12 周龄，购自扬州大学比较医学中心。小鼠B细胞淋巴瘤细胞株38B9受赠于美国宾夕法尼亚大学费城儿童医院。

2 主要试剂和仪器

逆转录试剂盒（11110ES92）和实时荧光定量PCR 试剂盒（11199ES03）均购自上海翌圣生物科技有限公司；高糖DMEM 培养液（SH30243.01）、RPMI-1640培养液（SH30809.01）和胎牛血清（SH30084.03）均购自HyClone；细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（P0027）购自上海碧云天生物公司；Trizol（15596018）购自Invitrogen；PCR 引物由安徽通用生物公司合成，序列见表1；14-3-3 alpha/beta Rabbit pAb（A1023）购自武汉爱博泰克生物科技公司；Hsp90α/β 抗体（F-8 sc-13119）购自Santa Cruz；山羊抗小鼠Ⅱ抗（G1214）和山羊抗兔Ⅱ抗（G1213）购自武汉赛维尔生物科技公司；CD19 磁珠（Cat#130-121-301）和LS Columns（Cat#130-042-401）购自Miltenyi；其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers

实时荧光定量PCR仪购自ABI；细胞甩片机（Cy‐tospin 4）购自Thermo Fisher；荧光显微镜（Axioscope 5）购自Zeiss；通用型免疫荧光工具箱（KTD107-CN）购自Abbkine；免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）试剂盒（Lot#D1215X01）购自Absin。

3 主要方法

3.1 数据资料收集 使用GEO 数据库（www.ncbi.nlm. nih. gov/geo）下载包含DLBCL 患者基因数据的GSE32918 和包含扁桃体样本及DLBCL 患者基因数据的GSE56315。数据集选取条件：（1）所选数据集包含全基因组的表达mRNA 芯片数据；（2）所选数据超过3个样本以上；（3）所选样本均为石蜡组织切片。

3.2 细胞培养 38B9 细胞接种于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培养液，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，隔天换液。人293T 细胞接种于10%胎牛血清的DMEM培养液中培养，隔2～3天换液。

3.3 细胞磁珠分选 取C57BL/6J小鼠骨髓、肠系膜淋巴结和脾脏，制备细胞悬液，在冰上裂解红细胞，然后使用小鼠CD19+磁珠纯化提取小鼠B细胞。

3.4 核蛋白与胞浆蛋白分离 取2×106个38B9 细胞，PBS 清洗干净后，4 ℃、2 000 r/min 离心10 min。使用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒向细胞沉淀加入胞浆蛋白抽提试剂A、B。4 ℃、12 000×g离心5 min，取上清至新EP 管中，即为抽提得到的胞浆蛋白。随后加入细胞核蛋白抽提试剂，4 ℃、12 000×g离心10 min，取上清至新EP 管中。取分离后的蛋白，采用Western blot 检测14-3-3β 在胞核和胞浆中的表达情况。

3.5 细胞免疫荧光染色 取5×104个38B9 细胞，用4%多聚甲醛固定15 min 后，4 ℃、2 000 r/min 离心10 min，PBS 重悬后取100 µL 用于细胞甩片。使用通用型免疫荧光试剂盒，先后加入破膜液、封闭液，PBS洗3次，随后加入14-3-3β 抗体，于湿盒内4 ℃孵育过夜，PBS 洗4 次。吸弃PBS，加入Ⅱ抗，避光室温孵育1 h。吸弃Ⅱ抗，PBS 洗3次。吸弃PBS，加入DAPI避光孵育10 min，PBS 洗3 次。玻片晾干后封片，使用荧光显微镜观察14-3-3β的表达和分布。

3.6 质粒构建 通过PCR 扩增目的基因Ywhab片段，限制性内切酶切割pBABE-Puro 载体和目的基因片段，使用琼脂糖凝胶电泳分离后回收。运用T4 连接酶将载体和目的基因片段链接，质粒转化后在含氨苄青霉素的LB 培养基上培养，以获得阳性菌落。经过测序验证正确后，对这些阳性菌落进行质粒抽提并进行逆转录病毒包装。

3.7 细胞转染与感染 （1）收集对数生长期的293T细胞并接种到10 cm 培养皿中。当细胞融合达到80%～90%时，通过Lipo6000转染试剂将pBABE-Puro和pBABE-Ywhab 质粒转染至细胞中，转染后36、48和60 h 收集培养液。（2）将对数生长期的38B9 细胞，取2×105个接种于6孔板，每孔加入2 mL 逆转录病毒液和2 µL polybrene，30 ℃、2 000 r/min 离心2 h感染，后续补充2 mL 完全培养液，24 h 后换液。细胞生长状态良好后加入1 mg/L嘌呤霉素进行筛选。

3.8 CCK-8 实验检测细胞活力 取对数生长期的38B9 细胞，以每孔2×104的密度接种于96 孔板，每组包含5个复孔，分别在第24、48和72 h进行检测。检测方法：每孔加入10 µL 的CCK-8 试剂，37 ℃孵育1 h，使用酶标仪检测450 nm 波长下各孔吸光度（A）。细胞相对活力（%）=A实验组/A对照组×100%。

3.9 RT-qPCR 检测Ywhab 及凋亡相关基因的mRNA 表达水平 使用Trizol 试剂提取细胞总RNA，细胞加入Trizol 后，冰上静置15 min，加入200 µL 氯仿并充分混匀，4 ℃、12 000 r/min 离心10 min。取最上层至新的无酶EP 管中，加入等体积异丙醇后混匀，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃掉上清液。使用DEPC 水配制75%乙醇清洗后以4 ℃、12 000 r/min离心10 min，弃掉上清液并干燥10 min。用适量ddH2O溶解RNA 并检测浓度及纯度后，使用逆转录试剂盒进行逆转录，合成cDNA。使用合成cDNA 样品配制RT-qPCR 反应体系。以GAPDH 作为内参照，用2−ΔΔCt法计算mRNA相对表达量，每个样本重复3次。

3.10 Western blot 检测14-3-3β 及凋亡相关蛋白的表达水平 取对数生长期的38B9 细胞及磁珠分选的B 细胞，离心收集细胞。用蛋白裂解液裂解细胞，涡旋仪裂解30 min。4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，取上清液至新的EP 管中。加入5× SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，95 ℃金属浴加热5 min。进行10% SDSPAGE，80 V 恒压电泳120 min。切胶放入预冷的转膜液中，200 mA 冰上转至PVDF 膜90 min。结束后将PVDF 膜转入含5%脱脂奶粉的1× TBST 中封闭90 min。孵Ⅰ抗4 ℃摇床过夜。回收Ⅰ抗，加入1×TBST 洗膜3 次。加入对应种属Ⅱ抗（1∶5 000）室温孵育60 min，加入1× TBST 洗膜3 次。将发光液均匀滴加在PVDF膜上，放入机器显影。

3.11 蛋白质Co-IP 和质谱检测14-3-3β 的结合蛋白 根据抗体与蛋白的特异性亲和作用，在38B9 细胞中通过14-3-3β 抗体特异性结合14-3-3β 蛋白，并且捕获与14-3-3β 蛋白相互作用的其他蛋白或者生物大分子，使用Protein A/G 凝珠结合14-3-3β 抗体，从而捕获以及富集目标蛋白，然后使用蛋白质谱方法分析14-3-3β可能结合的蛋白。

3.12 蛋白质分子对接 在PDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）获得蛋白结构，利用PyMOL软件处理蛋白结构，然后将蛋白结构上传，利用HDOCK 软件（http：//hdock. phys. hust. edu. cn/）进行蛋白-蛋白对接，最后选择对接最佳的组合，利用PyMOL 软件作图分析。

3.13 GEO 数据生物信息学分析 使用R 语言包Limma 消除批次效应以用于合并GSE32918 和GSE56315 测序数据，使用Survival 包进行单基因生存分析。利用Survminer 包将单基因纳入多变量Cox分析中。为了评估模型的稳健性，将风险评分公式，其中X代表系数，Y代表基因表达水平］应用于每个样本。随后，根据风险评分的中位数将样本分为高风险和低风险两类。风险评分分布、患者生存状态和基因表达热图被用于评估模型的准确性。此外，进行了单变量回归分析，以确定模型的预测准确性。

4 统计学处理

所有的统计分析及作图使用GraphPad Prism 8.0、Microsoft Excel 和Adobe Photoshop 软件。结果以均数±标准差（mean±SD）表示。两组间均数比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 DLBCL 患者淋巴结与正常人淋巴结中Ywhab表达的比较

对GEO 数据集GSE32918 和GSE56315 进行分析，结果显示，与正常人淋巴结石蜡组织样本相比，DLBCL 患者淋巴结石蜡组织样本中Ywhab 低表达（图1A）。Kaplan-Meier生存分析结果显示，Ywhab低表达组患者生存率显著低于高表达组（图1B）。多因素COX 回归模型表明，Ywhab 表达是DLBCL 患者生存的独立危险因素（图1C）；同时单因素风险回归模型分析结果表明Ywhab表达是影响DLBCL患者生存的危险因素（图1D）。根据以上数据进行风险评分，结果显示高风险组较低风险组的死亡率高，生存时间短（P<0.05）（图1E）。

Figure 1. Construction and validation of a risk model based on Ywhab gene associated with DLBCL prognostic features. A： expression of Ywhab in normal and DLBCL（ tumor） groups； B： Kaplan-Meier method and log-rank test were used to evaluate and com‐pare the survival rates of the patients with high and low Ywhab expression in the GSE32918 cohort； C： multivariate regres‐sion analysis was used to assess the association between risk scores and various clinical factors in the GSE32918 cohort； D：univariate regression analysis was used to assess the association between risk score and various clinical factors in the GSE32918 cohort； E： distribution of risk score， corresponding survival status， and expression level of Ywhab in the GSE32918 cohort.图1 与DLBCL预后特征相关的Ywhab基因风险模型的构建和验证

2 Ywhab在小鼠B细胞淋巴瘤38B9细胞中低表达

RT-qPCR 和Western blot 实验结果显示，Ywhab mRNA 及其蛋白14-3-3β 在小鼠B 细胞淋巴瘤38B9细胞中低表达，而在小鼠骨髓、淋巴结和脾脏正常B细胞中高表达，差异均有统计学意义（P<0.01），见图2。

Figure 2. Low expression of Ywhab in mouse B-cell lymphoma 38B9 cells. A： the mRNA levels of Ywhab in 38B9 cells， and CD19+B cells from wild-type（ WT） mouse bone marrow（ BM）， lymph node（ LN） and spleen（ SP） were detected by RT-qPCR；B： the protein levels of 14-3-3β in 38B9 cells， and CD19+ B cells from WT mouse LN were detected by Western blot.Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs 38B9 cells.图2 Ywhab在小鼠B细胞淋巴瘤38B9细胞中低表达

3 14-3-3β蛋白在38B9细胞中的亚细胞定位

Western blot 实验结果显示，14-3-3β主要在38B9细胞的细胞浆中表达（图3A）；免疫荧光染色结果与Western blot结果一致（图3B）。

Figure 3. The 14-3-3β protein was predominantly located in the cytoplasm of 38B9 cells. A： Western blot； B： immunofluorescence staining（ green， 14-3-3β； blue， DAPI； scale bar=50 µm）.图3 14-3-3β主要在38B9细胞的细胞浆中表达

4 Ywhab抑制38B9细胞的生长

RT-qPCR 和Western blot 实验结果显示，与pBABE-Puro 组相比，pBABE-Ywhab 组38B9 细胞中Ywhab 过表达6～10 倍（P<0.01），见图4。细胞计数法和CCK-8 实验结果显示，与pBABE-Puro 组相比，pBABE-Ywhab 组38B9 细胞活力 在48 和72 h 受 到显著抑制，见图5A、B。同时，小鼠体内荷瘤实验结果显示，Ywhab过表达可以显著抑制38B9 细胞在小鼠体内的生长（P<0.05），见图5C、D。

Figure 4. Establishment of Ywhab-overexpressing 38B9 cell line. A： the mRNA level of Ywhab was detected by RT-qPCR； B： the protein level of 14-3-3β was detected by Western blot. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs pBABE-Puro group.图4 过表达Ywhab的38B9细胞系的构建

Figure 5. Overexpression of Ywhab suppressed the growth of 38B9 cells. A： cell counting； B： cell viability detected by CCK-8 as‐say； C： photograph of subcutaneous tumors from mice； D： weight of subcutaneous tumors from mice. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs pBABE-Puro group.图5 Ywhab过表达抑制38B9细胞生长

5 Ywhab促进38B9细胞凋亡

RT-qPCR 实验结果显示，与pBABE-Puro 组相比，pBABE-Ywhab 组38B9 细胞中促凋亡蛋白Puma、Bax、Noxa、Casp6 和Casp7 的mRNA 水平均显著升高（P<0.05或P<0.01），而抑凋亡蛋白Bcl2的mRNA 水平显著降低（P<0.05），见图6A；Western blot 实验结果显示，与pBABE-Puro 组相比，pBABE-Ywhab 组38B9 细胞中Puma 和Noxa 蛋白水平显著升高（P<0.01），Bcl2蛋白水平显著降低（P<0.05），见图6B。

Figure 6. Overexpression of Ywhab promoted the apoptosis of 38B9 cells. A： the mRNA levels of apoptosis-related proteins were de‐tected by RT-qPCR； B： the protein levels of Puma， Noxa and Bcl2 were detected by Western blot. Mean±SD. n=3. *P<0.05， **P<0.01 vs pBABE-Puro group.图6 Ywhab过表达促进38B9细胞凋亡

6 14-3-3β 与Hsp90aa1 蛋白相互作用并抑制Hsp90aa1表达

Co-IP 结合质谱分析结果显示，14-3-3β 能够与Hsp90aa1 结合，见图7A、B。对质谱结果进行GO 富集分析发现，前5 条通路中有3 条通路与Hsp90aa1相关，见图7C。对Co-IP 结果进行了Western blot 验证并结合分子对接，显示14-3-3β 与Hsp90aa1 存在结合关系，见图7D、E。Western blot 结果显示，在38B9 细胞中过表达Ywhab显著抑制Hsp90aa1 的蛋白表达（P<0.05），见图7F。

Figure 7. 14-3-3β bound to Hsp90aa1 and reduced Hsp90aa1 protein level. A： Coomassie brilliant blue staining of proteins； B：mass spectrometry（MS） results； C： GO enrichment analysis of MS results； D： co-immunoprecipitation（ Co-IP） verifica‐tion； E： molecular docking results； F： the expression of Hsp90aa1 protein in Ywhab-overexpressing 38B9 cells. Mean±SD. n=3. *P<0.05 vs pBABE-Puro group.图7 14-3-3β结合Hsp90aa1并抑制其表达

讨 论

非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma， NHL）是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，并且发病率和死亡率都位列前十［8］。DLBCL 约占全球成人NHL的30%～40%［9-10］。尽管化疗药物、单抗和细胞毒药物单用或联用治疗显著改善了DLBCL 患者的结局［11-12］，然而近40%的患者仍然会出现复发［13-14］。因此，探讨DLBCL 新的生物标志物和潜在治疗靶点对于改善目前治疗的结果至关重要。

14-3-3 蛋白是一个普遍存在的高度保守的28～33 kD 酸性多肽分子家族，由Moore 和Perez 于1967年发现［15］，包含7 个家族成员（β、γ、ε、σ、ζ、τ 和η）［16］。14-3-3 参与所有真核细胞内的蛋白激酶信号通路和磷酸化依赖性蛋白-蛋白相互作用［17-19］，通过细胞周期调节多种细胞功能，包括DNA 损伤检查点的启动和维持、丝裂原活化蛋白激酶的活化、预防细胞凋亡、增殖和恶性转化。很多研究表明，14-3-3β的表达增加与胃癌、胰腺癌、肺癌等癌症发生发展相关［20-22］。然而，在血液系统肿瘤尤其是DLBCL 中的报道几乎没有。因此，本研究通过体内外实验探究14-3-3β 对小鼠B 细胞淋巴瘤的可能作用机制，为临床诊断和治疗淋巴瘤提供理论与实验基础。

本研究使用公共数据库研究显示，Ywhab 在人正常淋巴结组织中高表达。基于GSE32918 数据集，使用生物信息学方法构建单因素回归模型和多因素回归模型，提示Ywhab 作为风险保护因素发挥作用并与预后密切相关。为了进一步研究Ywhab 对小鼠B细胞淋巴瘤发生发展的作用及可能的机制，我们构建了过表达Ywhab的38B9 细胞系。本研究使用的38B9 细胞系是由癌基因v-Abl（Abl1）转化的小鼠前体B细胞［23］，但表达高水平MYC蛋白［24］，这一细胞系模型可以模拟人DLBCL 中MYC 高表达的特性［25］。实验结果表明，Ywhab过表达能够抑制38B9 细胞活力；RT-qPCR 和Western blot 实验结果表明，Ywhab过表达能够促进38B9 细胞凋亡。这说明Ywhab 对于小鼠B细胞淋巴瘤的发生和发展起到抑制作用。

Hsp90aa1 属于热休克蛋白家族成员，在很多肿瘤如头颈部鳞状细胞癌［26］、下咽鳞状细胞癌［27］和乳腺癌［28］中表达增加，被认为是多种癌症发展的促进剂［29］。研究表明，Hsp90aa1 通过JNK/P38 通路抑制细胞凋亡，促进肿瘤的发生［30］。此外，Hsp90aa1通常作为分子伴侣发挥作用［31］。本研究通过Co-IP、质谱结合生物信息学分析表明，14-3-3β 能够与Hsp90aa1结合；Western blot 实验结果表明，过表达Ywhab的38B9 细胞系中Hsp90aa1 蛋白表达水平显著降低，从而促进凋亡相关蛋白如Puma、Noxa 等的表达，并且抑制抗凋亡蛋白Bcl2表达。

综上所述，Ywhab 可以诱导小鼠B 细胞淋巴瘤38B9 细胞凋亡并发挥抗癌作用，其机制可能是通过与Hsp90aa1 结合抑制其表达，并促进凋亡途径。但Ywhab是否通过其他的作用机制抑制B细胞淋巴瘤，以及在其他肿瘤中是否也发挥抑癌作用仍需加强相关研究。本研究为DLBCL 的诊断和治疗提供更多的理论和实验依据。