循环肿瘤细胞与乳腺癌临床特征及疗效评估的相关性

华建峰 刘瑶 蒋浏馨 丁渡山 徐陌 叶芳★ 陈学冉

乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤，同时位居女性癌症死亡率的第二位［1］。我国，女性乳腺癌的发病率排名第一，还有逐年上升趋势。现阶段临床主要通过乳房切除手术治疗乳腺癌，但患者术后发生复发转移的风险仍然较高。据报道，接受根治性肿瘤切除的患者中，有相当一部分仍然保留临床上无法检测到的微转移或微小残留病变，这些微小病灶中的肿瘤细胞可能进入血液循环，成为后来转移或复发的来源［2］。在这种情况下，通常需要将手术切除与放化疗等辅助手段联合。对于乳腺癌患者，手术及辅助治疗的主要目的是控制疾病，缓解症状，延长生存时间。因此，疗效监测具有重要意义，目前临床疗效主要通过影像方法进行评价。循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是指从肿瘤病灶脱落，在血液中循环，并在渗出后进入远端器官的肿瘤细胞［3］。虽然只有少数逃逸到循环系统的肿瘤细胞可以存活并导致器官转移，但CTCs 仍然是一个有潜力的生物标志物，有助于癌症的早期诊断、治疗效果的监测以及预后的评估［4］。本研究还分析了CTCs 与临床病理特征的相关性以及治疗前后CTCs 计数的变化，以评估乳腺癌患者的疗效。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究选择2021 年6 月到2022 年11 月之间在中国科学院合肥肿瘤医院接受治疗的39 例女性乳腺癌患者的临床资料进行回顾性分析，患者平均年龄（52.13±7.89）岁。另选取同一时间段本院收治的30 名女性乳腺良性疾病患者作为对照组，其中乳房结节2 例，乳腺囊肿3 例，乳腺腺病24 例，乳腺炎1 例，患者平均年龄（45.33±8.08）岁。纳入标准：①经病理确诊为乳腺癌；②临床资料完整；③无意识、沟通障碍。排除标准：①有其他部位恶性肿瘤病史；②合并血液系统疾病；③哺乳期。本研究属于回顾性研究，经院伦理委员会批准免除伦理审查，豁免签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器

荧光原位杂交样品处理试剂盒（YYZH01，江苏莱尔）；7 号/8 号染色体着丝粒探针（CSP001，江苏莱尔）；低速离心机（DT5-2B，北京时代北利）；垂直混合仪（HS-3，宁波新芝）；原位杂交仪（TDH-500，杭州奥盛）；荧光显微镜（ECLIPSE Ni，日本Nikon）。

1.3 CTCs 检测方法

1.3.1 CTCs 阴性富集

样本以1 900 rpm（离心半径15 cm）离心5 min后先用红细胞裂解液去除红细胞，再用CD45 免疫磁珠去除白细胞，最后涂片干燥备用。阴性富集法通过逐步去除血液中的血细胞保留所有异常细胞实现最大效率的对CTCs 富集纯化。

1.3.2 imFISH 检测

样本过夜晾干，经过固定、洗涤、脱水处理后，孵育荧光原位杂交探针，运行杂交程序；再通过CD45 抗体的免疫荧光染色，过滤掉血源性细胞的干扰；最后使用DAPI 染液对细胞核进行染色，从而完成对CTCs 的特异性染色鉴定。

1.3.3 CTCs 的判定标准［5］

7 号或8 号染色体着丝粒探针任一荧光原位杂交信号点≥3 个，同时白细胞表面抗原CD45 染色阴性，计为一个CTC。乳腺癌患者外周血中CTCs≥2/3.2 mL 判定为阳性。

1.4 治疗方案

治疗方案包括外科手术、放射治疗、化学治疗、免疫治疗、靶向治疗。治疗原则均依据《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范（2019 年版）》［6］。治疗效果通过影像学检查评估，并分为部分缓解（Partial response，PR）、病变稳定（Stable disease，SD）、病变进展（Progressive disease，PD）。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0 和Origin pro-2019 软件进行数据分析。计量资料用（）表示，计数资料用n（%）表示，CTCs 阳性率与临床病理特征的组间比较采用Fisher 确切概率检验，治疗前后CTCs 计数比较采用t检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CTCs 计数与检出率

本研究中39 例乳腺癌患者在治疗前后均接受了CTCs 检测。治疗前共有34 例乳腺癌患者CTCs 检测为阳性，检出范围：2～7 个细胞，阳性率为87.2%（34/39）；接受治疗后，共有33 例乳腺癌患者CTCs 检测为阳性，检出范围：2～6 个细胞，阳性率为84.6%（33/39）；对照组均未检出CTCs（0/30），见图1。乳腺癌患者CTCs 检出率明显高于乳腺良性疾病患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 乳腺癌患者和对照组CTCs 检出数目分布图Figure 1 Distribution of the number of CTCs detected in breast cancer patients and control group

2.2 不同临床病理特征患者CTCs 阳性率比较

TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期患者CTCs 阳性率明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差异有统计学意义（P＜0.05）；发生淋巴结转移的患者CTCs 阳性率明显高于未发生淋巴结转移的患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。在不同年龄、肿瘤直径、远端转移情况、雌激素受体（ER）状态、孕激素受体（PR）状态、人表皮生长因子受体-2（HER-2）状态、Ki67 表达以及分子亚型中的CTCs 阳性率差异无统计学意义（P均＞0.05）。见表1。

表1 不同临床病理特征患者CTCs 阳性率比较［n（%）］Table 1 Comparison of CTC positivity rates in patients with different clinicopathological features［n（%）］

2.3 CTCs 数量变化与治疗效果的关系

39 例乳腺癌患者在接受治疗后，有4 例患者出现疾病进展（PD）；30 例患者疾病稳定（SD）；5例患者部分缓解（PR），见图2。不同治疗效果下的CTCs 检出率无明显差异（P＞0.05）。在疾病进展的4 例患者中，2 例CTCs 数目无变化，2 例CTCs数目增加；病情稳定的30 例患者中，9 例CTCs 数目无变化，5 例CTCs 数目增加，16 例CTCs 数目减少；疾病部分缓解的5 名患者中，2 例CTCs 数目无变化，3 例CTCs 数目减少，见图3。疾病进展的患者治疗前后的CTCs 数目差异无统计学意义（P＞0.05）；疾病稳定和部分缓解的患者治疗后的CTCs数目与治疗前相比显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 CTCs 计数比较（）Table 2 Comparison of CTC counts（）

表2 CTCs 计数比较（）Table 2 Comparison of CTC counts（）

图2 CTCs 数量变化与治疗效果的关系Figure 2 The relationship between the change in the number of CTCs and the treatment effect

图3 CTCs 在治疗前与治疗后的检出数目之间的变化分析Figure 3 Analysis of the change in the number of CTCs detected before and after treatment

3 讨论

从癌症患者血液中检测循环肿瘤细胞和循环肿瘤DNA 的技术被称作液体活检［7］。与侵入式组织活检相比，CTCs 检测具有创伤小、样本易获取、可提供动态监测信息的优点［8］。近年来，关于CTCs 在乳腺癌的辅助诊断、预后评估、复发监测、耐药性研究等方面的作用已有很多相关研究报道［9-10］。本研究通过阴性富集和免疫荧光原位杂交法检测了乳腺癌患者外周血中的CTCs 阳性率。87.2%（34/39）的患者CTCs 检测为阳性，在随机选取的30 例乳腺良性疾病患者中并未发现假阳性的CTCs 结果，CTCs 检测具有较高的特异度。与使用抗上皮细胞粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）结合免疫磁珠的阳性富集法相比，本研究采用的CD45 磁珠抗体阴性富集法通过去除白细胞使CTCs 富集纯化，具有鉴定CTCs 分子亚型的能力，但是也存在样本处理步骤多，细胞易丢失的缺点。CTC 检测技术的开展应用，使得对恶性肿瘤患者早期、全面的分析成为可能，将提高在肿瘤早期预防、早期诊断、分子分型及个体化用药、预后预测的水平［11-12］。

本研究进一步分析了乳腺癌患者CTCs 阳性率与临床病理特征的相关性。结果表明不同TNM分期下的CTCs 阳性率存在显著差异，处于高分期的乳腺癌患者CTCs 阳性率明显高于低分期患者。根据第八版AJCC 癌症分期手册［13］，Ⅰ～Ⅱ期乳腺癌直径小，仅有个别分型涉及同侧腋窝淋巴结转移，因此难以在血液中检测到CTCs；而发生淋巴结转移的乳腺癌患者具有更高的CTCs 阳性率，这正是CTCs 在血液和淋巴管系统循环的结果。然而，本研究并未发现有远端转移的乳腺癌患者与无远端转移的患者CTCs 阳性率存在明显差异，这可能与本次研究选取的样本数量较少有一定相关性。治疗前后CTCs 计数的变化为疗效监测和预后评估提供了有价值的参考。本研究根据临床影像学检查结果将患者分为进展、稳定、好转三种状态，其中进展提示治疗效果不佳，稳定和好转提示治疗有效。我们比较分析了各组患者在治疗前后CTCs 计数的变化情况与治疗效果的一致性。本研究发现治疗有效的患者CTCs 计数下降，但是治疗效果不佳的患者CTCs 数目差异无统计学意义，这可能是疾病进展组患者数量较少所致。总体而言，CTCs 是有潜力的疗效监测的动态观察指标。CTCs 结合现有临床诊疗标准制定完善的辅助诊断、治疗监测、复发转移监测、预后判断的机制，及时调整治疗和复查方案，可提前发现或预测转移，以期尽早治疗，获得更好的临床结局。

综上所述，通过阴性富集和免疫荧光原位杂交技术检测CTCs 对乳腺癌患者病情评估和疗效监测具有一定价值。本研究尚存在单中心、样本量相对较少的局限性，后续会通过增加样本量和延长随访时间对乳腺癌的预后进行更深入的研究和长期的跟进。