胶质瘤乏氧的影像学研究进展

王雪华,陈旺生

【关键字】 胶质瘤; 乏氧; 磁共振成像; 灌注加权成像; 正电子发射计算机体层成像

胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤,侵袭力强且恶性程度高,治疗后易复发,预后差[1]。胶质瘤的乏氧状态一直以来是研究的热点及难点,不仅因为乏氧程度与恶性程度及生物学活性有关,且影响着肿瘤的放化疗疗效,对改善肿瘤的预后及转归具有重要的临床意义[2]。传统检测乏氧方法有创且重复性差,影像学检查是一种安全无创的手段,能够以更客观的证据进行评价,在胶质瘤治疗中具有广阔的应用前景。本文就胶质瘤乏氧的影像学研究进展进行综述,为其临床治疗规划提供客观依据和指导,改善胶质瘤患者预后。

胶质瘤乏氧的生物学概述

缺氧是恶性肿瘤重要的特征之一,可促进肿瘤恶性生物学行为进展且增加放化疗抵抗性。缺氧主要由于肿瘤的快速增殖所需耗氧量增加,导致需氧量供不应求[3]。乏氧现象的出现与微循环结构受损及血管功能异常密不可分,以血流灌注、扩散和贫血最为重要,包括血流不足引起的灌注异常、扩散距离增加引起的氧含量不足、贫血性缺氧由肿瘤相关或治疗性贫血引起的血液氧运输能力降低引起。缺氧与细胞增殖及凋亡、血管生成、代谢和肿瘤免疫反应等生物学行为密切相关。缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)被认为是低氧促进肿瘤恶性进展的主要转录因子,主要表现在:①缺氧通过HIF-1α上调血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),VEGF促进内皮细胞增殖与血管通透性相关,此外VEGF通过抑制树突状细胞成熟,导致细胞毒性T细胞失活;还通过诱导调节性T细胞和髓源性抑制细胞诱导免疫抑制,从而逃脱免疫监视[4];②促进糖酵解以供应于肿瘤细胞快速增长所需的能量,即所谓的瓦博格效应;③近年来,越来越多的研究揭示了铁轻链蛋白(hypoxia induced ferritin light chain,FTL)与恶性肿瘤的关系[5],FTL是新的乏氧反应基因,该基因在缺氧条件下呈时间依赖性增加,HIF-1α通过直接与FTL启动子区HRE-3结合调控FTL表达。而FTL通过调控AKT/GSK3β/β-catenin信号通路调控促进其上皮间充质转化,增强了胶质瘤的迁移和侵袭等生物学行为。

低氧通过减弱放射线对DNA的损伤作用,抑制HIF的降解,促进其他细胞基因的产生,使其对放化疗的敏感性大幅度下降,导致耐药性的产生,让其适应在低氧情况下的侵袭特性,更容易发生转移,最终降低治疗效果。其耐药机制包括肿瘤异质性、免疫逃逸、基因超突变、肿瘤激活选择性拼接等[6]。低氧环境下细胞分裂有效上调,为肿瘤细胞扩散提供了途径,缺氧是一个有效扭曲进化速度的坩埚,加剧肿瘤的异质性[7]。

总之,乏氧被认为是肿瘤恶性进展和治疗耐药的主要因素之一,了解相关的代谢机制以及进展过程在临床治疗评估中发挥着重要作用。随着越来越多的乏氧基因及机制被发现,以此为靶点的治疗势必成为未来研究的热点。

胶质瘤乏氧成像的方法

早期测量组织氧浓度的方法包括:①缺氧内在标记物(如HIF-1、碳酸酐酶(carbonic anhydrase IX,CA-IX)、葡萄糖转运蛋白(glucose transporter, Glut)、VEGF等免疫组化染色方法,目前以检测HIF-1最为常用;②Eppendorf极谱氧微电极测量技术(POEs)通过直接侵入测量来确定PO2在肿瘤中的分布情况[8],但该技术由于侵袭性及重复性差,现很少应用于临床。另有学者通过体外使用生物还原性缺氧标记物(如吡莫尼唑)的技术[9],在细胞内需要以某种方式对感兴趣的组织进行采样,用吡莫尼唑进行标记,低氧环境下硝基咪唑分子被硝基还原酶降解,与细胞大分子结合后并被困在细胞内,最后通过吡莫尼唑抗体行免疫组化测量该分子得出氧浓度。作为术前评估,这些方法不仅有创还可能改变肿瘤内环境,降低疗效,在临床上应用受限。因此,发展无创且能实时动态评估肿瘤乏氧状态的方法是必然趋势。

随着神经影像技术的不断发展,包括中枢神经系统胶质瘤在内的各种肿瘤的体外和体内缺氧成像取得了重大进展,不仅可以提高肿瘤治疗的监测效能,还可以实时监测肿瘤乏氧状态,具有无创且安全方便等特点。

1.氧摄取分数成像

氧摄取分数(oxygen extraction fraction,OEF)指当血流流经脑组织时从中摄取氧百分比,反映了脑组织对氧的利用率,是脑缺氧的重要参数之一,广泛应用于神经系统疾病。目前,OEF的获取方法有PET及MRI,随着MRI技术的进展,已经开发了几种基于MRI的方法来测量人脑中的OEF,包括基于血氧水平依赖(blood oxygen level-dependent,BOLD)的方法、基于T2的方法和基于相位的方法[10]。

第一类方法是通过大静脉内T2弛豫时间将其转换为静脉血氧饱和度(Yv),然后计算出OEF,在此基础上,有学者通过应用T2弛豫自旋标记成像(T2-relaxa-tion-under-spin-tagging ,TRUST)技术,标记来回的静脉和静态组织的信号,通过简单的对照标记相减获取只含有静脉血流信号;然而与其他基于T2的方法相似,该技术由于空间分辨率差,只能测量大静脉血管的血氧饱和度来估计总体OEF值而难以实现定量乏氧区域。第二类方法是利用相位图像来检测静脉血和周围组织之间的磁敏感差异,其可以扩展到小静脉从而得到OEF的区域值。近年来,新兴的定量磁敏感图(quantitative susceptibility map-ping ,QSM)的出现,使得体素水平上获得磁化率绝对值成为可能。Fan等[11]通过QSM技术测量脑卒中患者的OEF,同时评估OEF与灌注状态的相关性,结果表明随时间变化,QSM可以量化患者的OEF。

BOLD-MRI原理:当顺磁性的血红素铁与氧结合时电子构型发生改变,血红素复合物的总自旋磁矩变为零;当血红素铁释放氧气时,它会恢复到顺磁性状态。因此,血红素铁的磁性状态可用作血氧水平的生物标志物,基于脱氧红细胞中血红素复合物的这些变化,组织中的血管网会改变磁场信号,改变程度取决于血氧水平,这种现象构成了BOLD对比度的基础[12]。通过BOLD技术量化后得出OEF,OEF一旦量化,再结合脑血流量(cerebral blood flow,CBF),根据菲克原理计算出脑氧代谢率( cerebral metabolic rate of oxygen,CMRO2) 。Christen等[13]建立大鼠胶质肉瘤模型后行BOLD磁共振成像,结果发现仅靠参数T2*确定氧合状态远远不够,需要额外测量值,如宏观场不均匀性和血容量分数,该测量值对BOLD磁共振成像准确评估组织氧合不可或缺。由于其微创性目前仅限用于动物,未来能否应用到其他肿瘤模型中研究缺氧,还有待论证。Tth等[14]对45例胶质瘤患者基于BOLD-MRI方法计算胶质瘤患者的相对氧摄取分数(relative oxygen extraction fraction,rOEF),rOEF由横向弛豫率(T2WI、T2*WI)和脑血容量(cerebral blood volume,CBV)计算得出,而后rOEF 图通过视觉和感兴趣体积分析,结果发现与免疫组织化学的结果一致,但在分析rOEF图时必须考虑铁沉积、出血和磁化率伪影等混杂因素,这需要在未来研究中加以解决。Hirsch等[15]认为rOEF 测量基于T2、T2*及CBV的独立量化,当受到其他因素影响时(如铁沉积)会缩短T2*,且CBV静脉分数的绝对量化很难实现,不可能真正定量测量rOEF,有必要进行大量的临床试验进一步验证。最近一项新的临床前试验使用胶质母细胞瘤小鼠模型进行BOLD-MRI,然后分析模型中的缺氧区域,并与免疫组化结果相比较,结果支持BOLD-MRI与原位小鼠模型中哌莫硝唑测量缺氧相关的假设[16]。Cho等[17]提出基于时间演变聚类分析(cluster analysis of time,CAT)提高定量磁化率图谱和定量血氧水平依赖成像(QSM+qBOLD或QQ)的联合模型,采集5例缺血性脑卒中患者图像,按照有无CAT的情况重建基于QQ的OEF和CMRO2,结果表明,CAT显著降低了基于QSM+qBOLD的OEF的噪声误差,CAT显著提高了基于QSM+qBOLD的OEF和CMRO2映射图谱的准确性。吴迪等[18]利用脑氧代谢成像新技术“CAT-QQ”探讨健康人群衰老进程中的脑氧代谢变化规律,结果证实CAT-QQ技术可以评估脑氧代谢参数,联合3D-pCASL技术能够对健康人群静息状态下的脑氧代谢及脑血流灌注进行精准测量。Zhang等[19]通过研究32例先兆子痫女性,利用QSM+qBOLD技术量化OEF,结果表明该技术生成的全脑和区域OEF值与金标准测量一致。

目前,OEF成像在测量血氧饱和度方面有广阔的应用前景,是最新的成像技术,单一的序列存在自身劣势,而不同序列相互结合效果更佳,目前该技术被广大学者应用于评估脑血管等疾病的乏氧,未来该技术是否能更好地应用于肿瘤乏氧有待更多临床研究证实。

2.灌注加权成像

灌注加权成像(perfusion weight imaging,PWI)将一定时间内毛细血管床的血流量进行可视化,能够非侵入性了解肿瘤内部的血流动力学特性,由于肿瘤生长迅速诱导肿瘤血管快速增殖,新生血管仍不能提供足够的氧称为慢性乏氧,而肿瘤的营养血管突然灌注异常导致肿瘤细胞广泛乏氧称为急性乏氧,通过了解微循环对评估氧含量具有重要意义,PWI包括CT和MRI的灌注成像,后者常用于脑氧代谢的测量和评估。MRI灌注加权成像的方法包括动脉自旋标记(arterial spin labelling,ASL)、基于T2动态磁敏感增强磁共振(dynamic susceptibilitycontrast MRI,DSC-MRI)与基于T1动态增强磁共振成像(dynamic contrast-enhanced MRI,DCE-MRI)[20]。灌注成像通过多参数评估乏氧,为其临床治疗规划提供客观依据及指导。

DCE-MRI能够提供肿瘤感兴趣区的重要生理和代谢信息,使用药代动力学模型提供功能参数,通过注射对比剂后,计算与定量模型相结合得出参数值来评估病变组织血供与细胞间隙之间对比剂交换,相关参数包括Ktrans、Ve、Vp和 Kep(Ktrans:反映血液灌注和血管通透性;Ve:细胞外血管外空间容积分数;Vp:血浆体积分数;Kep:对比剂回流率),参数之间的关系为:Kep=Ktrans/Ve,最后通过参数值评估组织血管通透性及乏氧状态。HIF-1是重要的乏氧诱导基因,由HIF-1a及HIF-1b两部分亚基组成,氧分压正常时,脯氨酰羟化酶将HIF-1a亚基羟基化;缺氧情况下,HIF-1a在细胞核中累积并与HIF-b形成功能性HIF,导致羟基化被阻止。HIF-1a在大多缺氧微环境中已得到验证,多项研究通过HIF-1a的免疫组化作为病理金标准,以验证DCE-MRI评估肿瘤缺氧的可行性和准确性。潘红利等[21,22]采用DCE-MRI技术研究SD大鼠原位C6胶质瘤模型中灌注参数与肿瘤乏氧状态之间的相关性,结果显示第3、4周的胶质瘤模型瘤内HIF-1α与Ktrans、Ve值之间存在负相关,而与第2周的Ktrans、Ve值之间无明显相关性,这可能是由于第2周的胶质瘤模型体积相对较小,且此时瘤内氧供应与氧消耗仍处于平衡状态,未形成明显乏氧区所致;研究证实,不同生长时期瘤内的乏氧状态与DCE-MRI定量参数表达之间具有一定相关性。Hou等[23]通过建立SD大鼠原位C6胶质瘤模型,于14、21和28天后分别进行DCE-MRI扫描,分析Ktrans、Ve、Kep、Vp等定量参数与HIF-1a、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、CD34免疫组化评分之间的相关性,结果发现不同时间点的参数不同,即乏氧程度不同;由此可见,DCE-MRI定量参数能够评估大鼠原位胶质瘤模型的乏氧状态。在此之前Jensen等[24]提出DCE-MRI可以评估胶质瘤术前缺氧和增殖增加的肿瘤区域,但由于样本量少,其应用受限。另有研究对34例胶质瘤患者术前行DCE-MRI、T1WI、T2WI扫描,结构图像上显示出活检目标和感兴趣区域,经过处理图像后得出每个感兴趣区域的Ktrans、Ve、Vp和Kep等定量灌注参数,在点对点基础上,对该部位进行无框架立体定向活检,每个样本被认为是一个独立的测量,分析DCE-MRI测量参数与活检样本HIF-1α之间的相关性,最后发现两个成像参数Ktrans、Ve与HIF-1α的表达相关,结果表明DCE-MRI参数是定量评估胶质瘤中HIF-1α的有效工具,相关参数可作为HIF-1α表达的替代指标[25]。

DCE-MRI通过分析测量参数与免疫组化中HIF-1α表达的相关性,从而评估肿瘤的乏氧状态,由于个体差异,仍需进一步的多中心、大样本量研究进行验证。

ASL通过标记动脉内H进行成像,通过对流入的血液进行空间选择性标记来反转其纵向磁化,是一种用于定量测量CBF的非侵入性MRI技术。由于血流量增加和大量氧合血红蛋白的存在,ASL可以通过静脉信号显示动静脉分流,有望成为未来临床检测动静脉分流的工具[17]。

DSC-MRI主要依赖于静脉注射顺磁性对比剂时,快速测量瞬时MR信号在通过大脑期间的变化,与其他灌注成像方法相比具有非常好的对比度和噪声比,提供绝对量化的CBF数值。脑血流灌注与脑功能密切相关,是大脑生理相关的最重要参数之一[26]。

Nabavizadeh等[27]通过分析16例胶质瘤以评估不同MR灌注技术在检测和量化胶质瘤患者动静脉分流和肿瘤缺氧方面的价值,动静脉分流导致向肿瘤输送氧气水平不同,造成肿瘤缺氧。DSC-MRI可以测量GBM中的组织灌注和受损的微血管系统,因此能够反映肿瘤微环境。ASL灌注可检测和量化大脑动静脉分流,DSC用于分析患者的血流灌注,以确定组织特征,结果显示33%患者存在血管分流,且平均缺氧高于无分流组;有与无分流组肿瘤具有不同的DSC灌注曲线特征,DSC灌注曲线的斜率、角度与肿瘤缺氧、Ki-67增殖指数密切相关,研究结果表明ASL和DSC灌注曲线分析相结合可评估胶质母细胞瘤的动静脉分流和肿瘤缺氧;该研究作为前瞻性研究,样本量小且单一,说服力明显不足。目前ASL与DSC-MRI主要应用于胶质瘤术前分级、进展及预后方面,关于该序列应用于评估胶质瘤乏氧方面的研究较少,未来有待更多学者进行更深层次的研究,寻找最佳的序列组合,高效监测胶质瘤乏氧。

3.正电子发射计算机体层成像

正电子发射计算机体层成像(positron emission tomography,PET)是定量测量CMRO2的金标准,早期通过吸入15O放射性示踪剂以及静脉注射含有15O的H2O量化CBV、CBF、OEF,进一步计算得出CMRO2。有学者通过对10例创伤性脑损伤患者及10例健康对照组行15O-PET及18F-FMISO成像[28],显像后测量脑血流量、脑血容量、脑氧代谢、氧提取分数和脑组织血氧饱和度,并比较其空间分布和生理特性,最后得出创伤性脑损伤后缺氧区氧扩散梯度增加,且损伤后的组织缺氧并不局限于结构异常的区域,也可在常规大血管缺血的情况下发生。但15O-PET方法可重复性差,耗时久,且高剂量电离辐射限制了其临床应用[27]。随着PET的快速发展,新兴PET技术可显示放射性核素标记的乏氧显像剂(如18F、125I、64Cu)在体内的分布, 能够在临床前和临床环境中通过静脉注射少量放射性药物来识别局部体内低氧血症, 对氧区域成像,且能够进行定量分析,目前是临床上评估乏氧应用最广泛的成像方法[29,30]。放射性核素在乏氧区域摄取的机制如下[31]:在氧分压正常的细胞中,黄嘌呤氧化酶将其硝基基团氧化成自由阴离子,随后阴离子被氧化排出细胞外;相反,在乏氧情况下,自由阴离子被还原并与细胞内大分子物质不可逆结合聚集在乏氧细胞内从而显像。乏氧显像剂分为硝基咪唑类和非硝基咪唑类,包括18F-FMISO、8F-FAZA、18F-FDG、64Cu-ATSM、18F-FETNIM等。目前,18F-FMISO是临床上应用最广泛的乏氧显像示踪剂[32]。Bekaert等[33]探讨了PET乏氧示踪剂18F-FMISO摄取与其缺氧和血管生成标志物之间的关系,对33例胶质瘤患者术前行18F-FMISO PET和MRI,根据有无摄取18F-FMISO乏氧示踪剂将患者分为两组,计算18F-FMISO乏氧示踪剂最大标准化摄取值 (maximum standardized uptake values,SUVmax)作为缺氧指标,手术后对肿瘤标本进行CA-IX、VEGF和HIF-1α免疫组化分析,发现缺氧程度与CAIX、VEGF和HIF-1α的表达有相关性,结果证实18F-FMISO可以用于监测胶质瘤的乏氧情况。Abdo等[34]对9例受试者行18F-FMISO PET,通过光谱分析确定不同程度灌注缺氧,肿瘤-血液比率(tumour-to-blood ratio,TBR)和肿瘤-正常组织比率(tumor-to-normal tissue ratio,TNR)用来量化肿瘤缺氧,结果显示光谱分析可以分离每个像素的成分并潜在地识别缺氧。18F-FMISO由于自身的亲脂性,导致其在血液中清除率低,药代动力学差,加剧其异质性改变,这些缺点限制了其在临床上的进一步应用,另有研究表明18F-FMISO PET的低氧显像应在注射后4 h后进行,以获得更清晰及准确的图像[35]。

与之相反,18F-FAZA具有高度亲水性,清除率高且成像时间快。Mapelli等[36]进行了一项临床前瞻性研究,对20例高级别胶质瘤患者行PET,计算乏氧参数最大标准摄取值(SUVmax)、平均标准摄取值(SUVmean)和对应于摄取18F-FAZA的肿瘤体积(18F-FAZA tumour volume,FTV)SUVmax 40%、50%和60%,根据TBR的不同阈值(1.2、1.3和1.4)估计缺氧量,结果发现乏氧参数与免疫组织化学标志物CA-I、HIF及Ki-67表达存在相关性,证实了18F-FAZA的摄取值可以提示肿瘤的乏氧情况。最近一项研究对17例HGG患者术前行PWI、dMRI和18F-FAZA PET检查以分别评估肿瘤血管化、细胞结构和缺氧情况,结果再次证实了18F-FAZA PET可用于评估和量化乏氧微环境的异质性[37]。在此基础上,18F-DiFA、18F-HX4亲水性及清除率更佳,未来能否应用于临床,值得期待。

乏氧示踪剂的应用越来越广阔,不仅用于胶质瘤乏氧评估,还可用于胶质瘤分级及分期、指导治疗和评估胶质瘤预后等。Hu等[38]对25例脑胶质瘤患者术前行18F-FETNIM PET/CT检查,结果显示SUVmax与胶质瘤分级呈正相关,且SUVmax高的患者3年总生存率明显低于SUVmax低的患者,提示SUVmax可对胶质瘤进行分级并预测预后。越来越多的乏氧示踪剂正在逐步应用于临床试验,如18F-FDG、64Cu-ATSM、18F-FETNIM。Gangemi等[39]在一项病例研究中发现,64Cu-ATSM PET/CT结果与缺氧标志物HIF-1α的表达之间存在高度相关性,提示64Cu-ATSM可用于检测胶质瘤乏氧。18F-FDG使葡萄糖代谢可视化,缺氧参数结合有氧和无氧糖酵解信息,从而更好地了解肿瘤生物学活性,更有针对性地指导治疗;但该示踪剂适合慢性缺氧的生物学反应,对于急性缺氧没有足够的时间显示葡萄糖代谢[40]。

总之,PET是目前最常用来评估肿瘤乏氧的成像方式,相对于MRI提供的血流信息,PET可以提供有氧的具体信息评估肿瘤缺氧、血管生成、增殖、侵袭,还可评估胶质瘤等级及预后。然而目前哪种示踪剂最适用于乏氧评估还无定论,寻找最佳乏氧示踪剂应用于临床是亟待解决的问题。

总结与展望

乏氧是胶质瘤恶性特征之一,缺氧引起肿瘤生物学行为的改变导致侵袭性增加,诱导对放射治疗的抵抗,导致预后不良,有必要寻找可靠且无创的影像技术来评估肿瘤缺氧。相比于以往的乏氧检测技术,影像技术表现出较多优点,PET是目前最常用来评估肿瘤乏氧的成像方式,但由于空间分辨率低和电离辐射的原因限制了其临床应用,MRI具有无电离辐射且可无创量化血氧水平等优势。随着MRI、PET硬件和软件的快速发展,示踪剂的更新换代也在逐渐引起人们的关注,相信未来能提供更精准的乏氧信息,用于指导临床治疗、判断治疗效果及评估预后。