靶向转录因子的抗肿瘤药物研发进展

路明英,胡唯伟,高兴华

(中国药科大学,江苏 南京 211198)

转录因子(TF)一般均包含两个蛋白质结构域:结合特定 DNA 调控序列的 DNA 结合结构域(DNA binding domain,DBD),招募各种转录辅因子以调节染色质可及性和转录输出的效应结构域(effector domain)。很多 TFs还包含一个或多个转录调节域,这些转录调节域通常用于TFs的定位和功能活动[1-2]。人类基因组中至少有1 600个TFs,其中约19%与疾病表型相关。因此TFs是疾病常见的驱动因素,这也使TFs成了有前景的治疗靶点[3-5]。但是大多数的 TFs是无序的,并且缺乏经典的小分子结合口袋[6]。随着对TFs的进一步研究以及药物研发技术的进步,靶向TFs的药物开发在阻断TFs与DNA相互作用、阻断TFs与其他转录因子或转录辅因子的结合、靶向TFs的PROTAC降解等多方面技术取得进展,改变了TFs小分子调节剂不可成药的局面。

1 抑制TFs与DNA结合

与催化酶上小而明确的底物结合口袋相比,TFs的 DNA 结合域(DBD)的表面很大,而且其唯一的已知配体是DNA分子,因此DBD通常被认为是“不可成药”的。TF-DNA 界面富含带正电的残基,例如赖氨酸和精氨酸残基,这增加了小分子调节剂与DBD的结合难度,使得直接靶向 TFs蛋白质-DNA 相互作用区域更具有挑战性。开发抑制TF- DNA 特异性结合以抑制TFs活性的小分子经历了长期探索,在结构水平上对TF-DNA 结合的日益了解以及药物筛选技术的不断进步提高了靶向DBD小分子的筛选效率,目前已有一些药物的研发取得了进展并逐步走向临床。

信号转导和转录激活因子 3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)通过调节肿瘤生长、转移、血管生成和免疫逃逸相关基因的表达,在癌症发生发展中发挥重要作用。在生长因子和激素等共同的作用下,受体相关的Janus激酶(JAK)和Src激酶通过磷酸化C末端的酪氨酸残基使STAT3活化。磷酸化的STAT3单体形成功能性二聚体并在细胞核中积累,进而结合TFs基序并诱导靶基因的表达。STAT3与其下游基因启动子区之间的物理相互作用对于STAT3的转录活性至关重要,因此 STAT3 的DNA 结合域(DBD)是一个潜在的药物靶点。阻断STAT3-DNA结合的 STAT3 诱饵寡脱氧核苷酸在临床前研究中证明了靶向 STAT3 DBD的可行性[7]。Huang等[8]使用靶向 STAT3 -DNA 结合域的改良虚拟筛选策略,筛选得到了 STAT3 抑制剂 inS3-54。化合物inS3-54 选择性地抑制STAT3与DNA的结合而不影响 STAT3 的激活和二聚化。InS3-54 抑制STAT3下游靶基因的表达并抑制STAT3与染色质的结合。InS3-54促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞迁移和侵袭。然而,Huang等[9]进一步的研究发现,inS3-54存在一定的脱靶效应,对inS3-54进行结构优化后获得了一种新的先导化合物(inS3-54A18),它具有更高的特异性和更好的药理学特性。InS3-54A18不仅直接与 DBD 结合,抑制STAT3与DNA的 结合活性,还能有效抑制 STAT3 下游靶基因的表达。此外,基于已知药效团的结构改良进一步确定了新的STAT3 DBD的抑制剂 LC28 及5种类似物,这些化合物通过进一步的修饰和开发,为治疗顺铂耐药的卵巢癌提供了新的治疗策略[10]。

转录因子 Forkhead box O3 (FOXO3)及其家族成员识别并结合相同的核心 DNA 元件(TTGTTTAC),以控制靶基因的转录。FOXO3 通过转录调控FOXP3来调控调节性 T 细胞(regulatory T cell,Treg)的分化,Treg细胞抑制细胞毒性T 细胞的抗肿瘤作用[11]。小分子化合物对 FOXO3 活性的可逆抑制能增强抗肿瘤免疫反应并降低FOXO3 功能失活带来的副作用。Hagenbuchner等[12]的研究结合了计算机药效团建模和荧光偏振方法,确定了直接与 FOXO3 DBD 结合的小分子化合物 S9 及其草酸盐 S9OX 。化合物 S9 及其草酸盐 S9OX 阻断 FOXO3 与靶启动子的结合,抑制Treg细胞中FOXO3下游靶基因的表达。

总之,TF-DNA 的相互作用对于基因表达的调节至关重要,并与多种类型的癌症有关。小分子数据库、大规模虚拟筛选和其他计算机辅助药物筛选等技术的发展提高了靶向TF-DNA 位点的可行性,AI(artificial intelligence) 和深度学习平台的发展将促进药物靶标识别、蛋白结构预测,这些方法将使得靶向TFs的蛋白质-DNA 相互作用药物研发取得更好的发展[12]。

2 抑制TFs的蛋白-蛋白相互作用

蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)是蛋白质与其配体之间的物理相互作用,在多种癌症中,PPI的异常促进了肿瘤的发生发展。抑制异常的PPI 可能是一种有效的癌症治疗方法。肿瘤细胞细胞核中多种TFs存在异常的蛋白-蛋白相互作用,这为利用药物来抑制这种相互作用提供了可能[14]。这些相互作用包括TFs之间的相互作用,以及参与转录的多种共激活因子和TFs的相互作用。因此,阻断TFs和其他TFs或转录辅因子的相互作用,成为抑制TFs转录调控的新方向。

在70%的人类恶性肿瘤细胞中,MYC基因表达水平失调。由于异常表达的MYC在肿瘤发生发展过程中的关键作用,因此其成为了肿瘤治疗的潜在靶点[15]。目前已知的MYC基因家族包括3个成员,C-MYC、L-MYC和N-MYC。它们均属于碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(bHLHLZ)DNA结合蛋白超家族。C-MYC(以下简称 MYC)是一种由 439 个氨基酸组成的蛋白,包含一个特征明确的 C 端 DNA 结合域和一个 N 端反式激活结构域(TAD)。C 端DNA结合域约 有100 个残基,包含一个螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链(bHLH-LZ)片段,该片段调节 MYC 与转录因子MAX 之间的异二聚化,介导其与基因启动子的结合。抑制MYC与MAX蛋白二聚化提高了MYC抑制剂的成药性[16]。SaJM589 通过破坏 MYC-MAX 异源二聚化并促进蛋白酶体介导的 MYC 降解,抑制多种肿瘤细胞增殖[17]。最近发现的另一种小分子化合物 MYCMI-6 也通过结合 MYC 的 bHLH-LZ 结构域来抑制 MYC-MAX 异源二聚化[18]。体外试验发现MYCMI-6 抑制 MYC 依赖性的细胞生长,这种作用与肿瘤细胞中 MYC 表达水平相关。化合物 KSI-3716 可阻断 MYC-MAX 与 DNA 的结合进而抑制肿瘤的增殖[16]。以上研究证明靶向抑制MYC蛋白-蛋白相互作用的药物具有很好的抗肿瘤前景。

p53是一种包含有393个氨基酸的转录因子,可通过多种机制如DNA 修复、细胞凋亡、细胞周期停滞、衰老、新陈代谢和自噬等途径抑制肿瘤的发生发展。在肿瘤细胞中,MDM2介导p53蛋白的泛素化,通过促进p53蛋白的降解使其蛋白表达维持较低水平。因此,破坏 p53-MDM2的相互作用可以上调肿瘤细胞中P53的蛋白表达,发挥P53蛋白的抑瘤作用。Nutlins 是首个被报道的MDM2 抑制剂,它是由 Hoffmann-La Roche对合成化合物进行筛选时发现的。为提高其效力和选择性,研究人员通过化学优化的方法合成了第一个先导化合物 Nutlin-3a[19]。在此基础上发展得到的 RG-7112,在WT-P53肿瘤细胞中的平均IC50为400 nmol·L-1,RG-7112也是第一个进入临床试验的MDM2 抑制剂[20]。临床试验表明,MDM2抑制剂可以激活肿瘤细胞中的p53信号,证明了该小分子化合物研发方向的可行性。Wang研究团队通过对天然产物结构的改造,发现了新型MDM2抑制剂螺羟吲哚衍生物[21-22],并以其中的MI-219作为先导化合物,对其进行进一步优化得到 MI-773,目前MI-773已进入临床试验。 Espadinha等[23]研究团队对螺吡唑啉羟吲哚类化合物进行结构优化,开发了抑制MDM2-p53 和 MDM4-p53 蛋白-蛋白相互作用的一系列双重抑制小分子,发现有两个化合物以浓度依赖性方式诱导 SJSA-1 细胞凋亡,显示出较好的抗癌活性。Si等[24]参考查尔酮与MDM2的结合模式,经过虚拟筛选得到不饱和吡咯烷酮结构,合成的不饱和吡咯烷酮衍生物显示出与MDM2优异的选择性和抗肿瘤活性。

通过开发小分子药物来抑制TFs的PPI是治疗疾病的有效策略。外源性介入PPI 的治疗方法旨在抑制蛋白质复合物的组装和抑制蛋白复合物的稳定性[25]。装订肽通过在两个氨基酸侧链之间形成共价键,将短线性肽限制在天然 α 螺旋构象中,从而产生有效的PPI 抑制效果。Sharma等[26]报道了一种用于抑制 p53-MDM2 相互作用的钉合肽。以上研究提示通过开发肽类药物来抑制p53-MDM2 相互作用是一个很好的研究方向。

在肿瘤学领域,药物发现中用于PPI抑制剂开发的技术包括基于片段的筛选、计算分析和分子抑制剂设计。针对TFs与其他蛋白之间相互作用设计的PPI 抑制剂可能存在以下的缺点:反应性低、存在脱靶毒性、可能产生免疫原性等,克服这些挑战将为针对TFs的PPI药物开发提供新的可能。

3 蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)技术靶向降解TFs

蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)技术的开发是通过设计双功能小分子嵌合体将感兴趣的蛋白质(POI)带到 E3 泛素连接酶的附近,从而诱导 POI 的泛素化并通过蛋白酶体途径降解。通过将离散的靶蛋白配体与 E3 连接酶进行有效的连接,PROTAC提供了靶向TFs的快速降解途径。与小分子抑制剂相比,PROTAC 具有多项优势,包括扩大靶蛋白范围、提高选择性、降低毒性和避免抑制剂耐药性[27]。

迄今为止,两种口服活性较好的PROTAC类TFs抑制剂 PROTAC ARV-110 和 ARV-471 已进入临床。 雄激素受体(AR) 降解剂 ARV-110 在 AR 野生型前列腺癌患者以及 AR T878A 和 H875Y 突变体患者中显示出更好的治疗效果。已有的AR抑制剂恩杂鲁胺和醋酸阿比特龙对携带AR T878A和H875Y突变群体的治疗效果不佳[28]。雌激素受体(ER)降解剂 ARV-471 在具有野生型和突变型 ER 的乳腺癌患者中均显示出良好效果[29]。两种高效的 TFs 降解剂 ARD-69 和 ARD-61,分别用于治疗 AR 阳性前列腺癌和乳腺癌[30-31]。ARD-2585 和 ARD-2128 是两种可口服、高效的AR降解剂,ARD-2585诱导携带AR T878A 突变的雄激素敏感性前列腺腺癌细胞LNCaP AR降解,并可诱导 T878A突变和L702H 突变的雄激素敏感MDA-PCa-2b细胞AR降解[32-33]。PROTAC 溴结构域抑制剂 ARV-825 通过抑制MYCN或c-Myc的表达在神经母细胞瘤中显示出抗肿瘤活性[34]。Kaneshige等[35]发现一种有效的选择性 STAT5 PROTAC 降解剂 AK-2292,其在体内对急性髓系白血病具有强抗肿瘤活性。

通过使用TFs靶向嵌合体(TRAFTAC)模拟其内源性配体DNA,可靶向 TFs并使其降解[36]。TRAFTAC包括一个识别TF的短双链DNA序列,该dsDNA与sgRNA相关联,而该sgRNA可被spCas9 识别,后者充当调节器,通过 dCas9-HaloTag 融合体将 TF-TRAFTAC 结合到 E3 连接酶上。HaloTag 是一种经过修饰的细菌脱卤素酶,可与己基氯结合基团发生共价反应。当HaloTag连接到结合 von Hippel-Lindau(VHL)E3 连接酶的弹头时,生成的 HaloPROTAC 将 VHL 募集到 HaloTag-靶标融合体。 HaloPROTAC使VHL 被招募到 dCas9-HaloTag 适配器以诱导目标TFs的降解。通过结合使用 TRAFTAC、dCas9-HaloTag 和 HaloPROTAC,两种转录因子 NF-κB 和 brachyury被靶向降解。但是TRAFTAC 系统的所有3个组分(dCas9-HaloTag、TRAFTAC、HaloPROTAC)需同时进入细胞中才能产生活性降解复合物,这在临床应用上有一定的难度。Shao等[37]构建出更为简单的O′PROTAC 靶向TFs进行降解。O′PROTAC将双链寡核苷酸作为 POI 结合部分结合到 PROTAC 中,在ERG和LEF1的靶向降解中取得成功,O′PROTAC 的合成非常简单高效,有助于快速开发 O′PROTAC 文库,用于高通量筛选有效的TFs降解剂。

在转录因子的71个家族中,zinc finger C2H2转录因子的数量超过600个,占比超过所有转录因子数量的一半[38]。沙利度胺、来那度胺和泊马度胺是临床批准用于治疗多发性骨髓瘤和其他血液系统恶性肿瘤的药物。这些药物通过锌指转录因子中存在的 Cys2-His2(C2H2)锌指(ZF)结构域将它们招募到 CRL4CRBNE3 泛素连接酶,进而介导TFs降解。沙利度胺类似物结合 Cereblon(CRBN)—— E3 泛素连接酶的底物受体,改变CRBN底物选择性以招募泛素来降解蛋白质,包括 Ikaros(IKZF1)、Aiolos(IKZF3)和酪蛋白激酶 1 α(CK1α)[39-42]。Sievers 研究小组进一步确定了通过沙利度胺类似物和CRBN降解的锌指转录因子降解子的特征,为含C2H2 ZnF转录因子的靶向降解提供了新方法[45]。

就临床实践而言,PROTAC药物仍处于研发的早期阶段,存在开发缓慢且成功率低、膜通透性和口服生物利用度差、人体临床研究证据不足等挑战。但随着研究的深入,这些问题将逐步得到解决,一旦获得临床突破,将开启药物创新的新纪元[44]。另外,只有不到 2% 的E3连接酶用于靶向降解,因此,开发可用于转录因子靶向降解的新型E3连接酶是一个很有价值和潜力的研究方向。总之,这些技术突破能极大地促进靶向TFs的治疗药物的发展。

4 总结与展望

肿瘤细胞高度依赖TFs的异常驱动来支持它们的生长和存活。对 TFs作用机制的深入了解,可以更好地了解它们在癌症和其他疾病中的作用。参与肿瘤发生发展的一些关键TFs是炎症相关的TFs,例如NF-κB、STAT3 和 AP1等,它们调控了肿瘤的发生发展;缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)通过激活并维持肿瘤细胞干性,促进肿瘤细胞侵袭、转移和血管生成等相关基因的表达,在肿瘤的恶性进展中起到了重要的驱动作用;C-Myc 和 E2F1的异常表达解除了细胞周期的限制,导致了肿瘤细胞不受控制的细胞分裂;β-catenin 和 ETS1 促进上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT) 和转移,而 核受体(nuclear receptors,NRs) 在激素敏感性肿瘤中起关键调控作用。TFs 在化疗后的异常表达导致EMT 和肿瘤干性的增强,对癌症治疗造成重大挑战。因此研究人员近年来在靶向TFs的药物开发方面进行了不断的尝试,从TFs生理作用特点和结构特点两个方向着手创新药物的开发,以控制癌症中失调的TFs,使其由不可成药的靶点转化为有潜力的治疗靶点。

药物开发的主要局限之一是大多数化合物都调控蛋白质的酶活以实现其靶向性,而靶向没有酶活性的致癌蛋白的药物非常有限[45-46],TFs属于缺少酶活位点并与癌症发生和发展密切相关的蛋白。基于TFs在癌症中的重要驱动作用,研究人员在开发靶向TFs的药物研究中做了很多工作,其中一些研究成果已经进入临床试验,但由于副作用、毒性和低耐受性的缺点,只有少数药物最终成功进入临床。然而,最近在药物设计和开发方面取得的技术有希望改善这一现状,包括计算机辅助分子建模和基于结构的药物设计等新技术为开发出更好的靶向 TFs的药物提供了很多技术支持。破坏蛋白质-蛋白质相互作用及其与 DNA 的结合,以及通过调节染色质可及性来限制表观遗传调控是靶向 TFs的新兴策略。鉴于癌细胞对 TFs 的依赖性以及单一化学疗法容易产生耐药性,因此靶向 TFs 的药物与目前的化疗及靶向治疗的组合可能是未来癌症治疗的有效策略。最近的研究表明基于 NR的疗法也可能影响免疫反应,TFs靶向药物与免疫疗法相结合在癌症治疗中展现出巨大的潜力。

由于转录调控同时参与维持细胞的正常生理功能,靶向 TFs 的抑制剂容易产生毒副作用。然而,随着研究的不断深入,可以通过筛选识别肿瘤细胞特异性的TFs来降低药物毒性。此外,针对癌症中特异性转录因子抑制剂的开发必须考虑到同一家族中彼此非常接近的不同转录因子之间可能产生的代偿现象,因此必须进一步阐明TF-DNA 或辅因子相互作用的详细分子机制,以提供靶向转录因子新的开发策略[47]。抑制转录因子治疗癌症已逐渐成为目前抗肿瘤药物开发很有前景的研究方向,该研究策略同样可适用于其他疾病,如遗传或炎症性疾病、糖尿病、帕金森和阿尔茨海默病等。