非小细胞肺癌组织中CLCA4的表达情况及与病理和预后的关系

吴媛媛 刘科 齐艳丽 童小华

1商洛市中心医院病理科，商洛 726000；2商洛市中心医院呼吸与危重症医学科，商洛 726000

非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常见的肺癌类型，占85%以上［1-3］。尽管近年来针对NSCLC的诊疗技术不断进步，但该疾病的发病率和病死率仍居高不下。因此，寻找新的治疗靶点和标志物对于NSCLC 的诊疗及预后评估至关重要。钙激活的氯离子通道A 4（calcium-activated chloride channel regulator 4，CLCA4）是一种离子通道调节蛋白，在人体中广泛分布，并参与多种生理过程［4］。CLCA4 可通过调节磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 信号通路（PI3K/AKT）、Janus 激酶2/信号转导与转录激活子3（JAK2/STAT3）等肿瘤细胞增殖的信号途径，介导结直肠癌的病理改变［5-6］。而PI3K/AKT、JAK2/STAT3 等肿瘤信号作为NSCLC 病理进展的关键信号途径，部分学者认为CLCA4的表达与NSCLC 的病理进展及预后存在关联［4］。然而，目前对于CLCA4 在NSCLC 中的作用和机制研究资料有限，能否成为NSCLC 新的治疗靶点尚待验证［5］。基于此，本文旨在探讨CLCA4 在NSCLC 组织中的表达情况，并研究其与病理及预后的关系，为NSCLC 的诊疗及预后评估提供新的思路和策略。

资料与方法

1.一般资料

前瞻性选取商洛市中心医院2019年4月至2022年4月收治的106 例NSCLC 患者进行研究。（1）纳入标准：①符合肺癌的临床诊断［7］，术前经病理穿刺活检确诊；②符合手术指征，均行NSCLC根治性切除术，术后留存病理组织送常规病理。美国麻醉师医学会分级I～Ⅱ级；③TNM 分期Ⅱ～ⅢA 期；④卡氏健康评分＞65 分；⑤年龄＞18 岁；⑥患者家属均签署知情同意书。（2）排除标准：①转移癌；②NSCLC 复发；③肝、肾功能衰竭；④合并其他呼吸道急性感染；⑤心脑血管急症治疗期；⑥妊娠期、哺乳期女性；⑦病历资料缺失或不接受随访。

本研究通过商洛市中心医院医学伦理委员会批准（伦理编号：2019-001）。

2.研究方法

术后收集患者的临床资料，采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测癌组织及癌旁正常组织中CLCA4的表达情况。

2.1.资料收集 人口学资料包括性别、年龄、体质量指数（BMI）、吸烟、肺癌家族史；病理资料包括组织类型、分化程度、肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移。

2.2.CLCA4 阳性表达检测 采用免疫组化法检测病理组织中CLCA4 阳性表达情况。采用半定量评分法判定结果：染色强度分为无染色、弱染色、中等强度染色、强染色，对应评分依次记为0分、1分、2分、3分；染色数量分为阳性细胞占比＜5%、5%～25%、＞25%～75%、＞75%～100%，对应评分依次记为0分、1分、2分、3分。染色强度和染色数量得分之和≥2分判定为阳性（阳性细胞占比＜5%直接记为阴性。）

2.3.CLCA4 表达检测方法 病理标本置于RNAlater 保护液中，-80 ℃冷冻保存，检测前离心去除保护剂。将组织标本置于液氮中研磨成粉，依次提取总RNA、逆转录成cDNA，-20 ℃冷冻保存，预备PCR扩增。PCR反应体系20 μl，反应条件：95 ℃预变性10 min、变性15 s、60 ℃退火1 min、延伸温度68 ℃，40个循环。取3个样本复孔的均值，以CT值为基础，采用2-△△CT法计算CLCA4 mRNA的相对表达量。

2.4.随访及分组 所有患者术后采用门诊复查、电话随访等方法跟踪随访12 个月，观察无病生存期（disease-free survival，DFS）情况。

3.统计学方法

数据处理采用SPSS 24统计学软件，计数资料以构成比或率（%）表示，采用χ2检验；符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，采用t检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。影响因素的分析采用多因素logistic逐步回归模型，生存曲线Kaplan-Meier 分析与对数秩检验，绘制受试者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）评估预测效能。

结果

1.CLCA4表达（表1）

表1 106例非小细胞肺癌患者癌组织、癌旁正常组织中CLCA4表达分析

癌组织中CLCA4 阳性率及CLCA4 mRNA 的相对表达量均低于癌旁正常组织（均P＜0.05）。

2.不同病理分期患者的CLCA4表达

42 例Ⅱ期患者的CLCA4 mRNA 表达量为（0.69±0.15），64 例ⅢA 期患者的CLCA4 mRNA 表达量为（0.61±0.13），差异有统计学意义（t=2.914，P=0.004）。

3.不同预后组患者的临床资料比较（表2）

表2 不同预后非小细胞肺癌患者的临床资料比较

106例患者均正常随访12个月，其中非DFS组58例，DFS组48例。两组患者的性别、年龄、BMI、吸烟、肺癌家族史、组织类型、分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）；非DFS组中ⅢA期患者例数高于DFS组（P＜0.05），CLCA4 mRNA表达量低于DFS组（P＜0.05）。

4.预后影响因素分析（表3）

表3 106例非小细胞肺癌患者预后的影响因素分析

以NSCLC 患者死亡为因变量（是=1，否=0），logistic 回归分析得出，TNM 分期（OR=4.031，95%CI1.429～11.364，P=0.003）、CLCA4 mRNA 表达量（OR=0.310，95%CI0.109～0.873，P=0.003）均是NSCLC患者DFS的影响因素。

5.预测效能分析（图1）

图1 CLCA4 mRNA预测106例非小细胞肺癌患者DFS的ROC

ROC 分析得出，CLCA4 mRNA 预测NSCLC 患者DFS 的最佳截断值为0.60，灵敏度为0.802（95%CI0.715～0.893）、特异度为0.809（95%CI0.721～0.904）、曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.857（95%CI0.782～0.935）。

6.生存预后分析（图2）

图2 不同CLCA4 mRNA 表达水平的非小细胞肺癌患者的DFS曲线比较

基于5.中CLCA4 mRNA 预测NSCLC 患者DFS 的最佳截断值，将患者分为CLCA4 mRNA高表达组和低表达组，其中CLCA4 mRNA 高表达组50 例，死亡2 例；低表达组56 例，死亡11 例。两组患者的生存曲线比较，差异有统计学意义（Log-rankχ2=6.006，P=0.014）。

讨论

NSCLC 作为全球生存率最低的实体瘤，基因蛋白的异常表达与肿瘤细胞增殖、浸润及转移密切相关［8-11］。根据全球癌症2020 年数据报道［12］，肺癌是导致癌症相关死亡的主要原因，我国约30%的癌因死亡与肺癌有关，且发病率及病死率一直呈现升高趋势。近几年随着靶向［表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂、间变性淋巴瘤激酶（ALK）融合基因、C-ros原癌基因1酪氨酸激酶（ROS1）融合基因等］、免疫［程序性死亡受体1（PD-1）、程序性死亡受体配体1（PD-L1）、细胞毒性T 淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）抑制剂等）］等生物疗法不断取得突破，肺癌患者的生存效果显著改善，但5 年总生存率仅保持在20%，且晚期NSCLC 患者的预后更差［13-15］。因此，针对NSCLC 新型诊疗靶点的探索一直是临床医学者研究的重点。

本研究尝试探究CLCA4 在NSCLC 组织中的表达情况以及与病理和预后的关系，结果表明，与癌旁正常组织比较，癌组织中CLCA4 mRNA 的相对表达量更低，且随着NSCLC 患者的病理进展，CLCA4 表达量呈降低趋势。与Li和Huang［6］、陈慧莉等［16］报道的CLCA4 在结直肠癌、乳腺癌中的表达均被抑制一致。Horaira等［17］研究提出，在癌组织中CLCA4基因甲基化改变可导致其表达水平下降。因此，本研究分析NSCLC 组织中DNA 甲基化改变是导致CLCA4 表达降低的原因之一，CLCA4 mRNA 表达量与NSCLC 患者的DFS预后相关，且在NSCLC 患者DFS预测中效能表现良好。同时，CLCA4 mRNA 高表达组与低表达组生存曲线存在差异，进一步证实CLCA4 表达的变化与NSCLC 的病理进展及预后密切相关。JAK2/STAT3 信号通路被广泛认为是与肿瘤细胞增殖密切相关的一条信号通路，JAK2/STAT3 信号通路的活化可诱导靶向基因的转录及翻译，促进肿瘤细胞的增殖、生长和转移［18-21］。早期研究表明，JAK2/STAT3 信号通路可通过介导干扰素-γ、白细胞介素-10 等细胞因子激活JAK2酪氨酸激酶，从而使其磷酸化并激活STAT3转录因子［22-23］。激活的STAT3可通过转录调控启动子区域的结合，诱导靶基因（如cyclin D1、c-myc、Bcl-2等）的转录和翻译，从而促进细胞周期的进程［24-26］。在肝癌、乳腺癌、肺癌等［27-28］多种恶性肿瘤中都存在JAK2/STAT3 的异常激活。Xiong 等［29］发现CircRPPH1 通过PI3K/AKT 和JAK2/STAT3 信号通路促进NSCLC 细胞的增殖、迁移和侵袭。在NSCLC 的治疗中可通过阻断JAK2/STAT3信号通路和抑制msi2 细胞活性抑制肿瘤细胞的增殖和转移［30］。而蒋可心等［31］研究发现，CLCA4对JAK2/STAT3信号通路具有抑制作用，且该信号途径可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭。因此，CLCA4 与JAK2/STAT3信号通路的相互作用，同样是影响NSCLC病理进展及预后的关键。后续临床实践可通过检测NSCLC癌组织中CLCA4 的变化，辅助诊断或评估NSCLC 患者的病理状态，且可能成为后续治疗NSCLC的新型靶点。

综上，NSCLC 患者癌组织中CLCA4 表达被抑制，且与病理进展及DFS 预后有关。但鉴于本研究纳入样本量有限，后续仍需完善多中心、大样本随机对照研究，证实本研究结论。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明吴媛媛：酝酿和设计试验，实施研究，采集数据，分析/解释数据，文章撰写，统计分析，获取研究经费，行政、技术或材料支持，指导，支持性贡献；刘科、齐艳丽：采集数据，对文章的知识性内容作批评性审阅，统计分析，支持性贡献；童小华：酝酿和设计试验，分析/解释数据，对文章的知识性内容作批评性审阅，获取研究经费，行政、技术或材料支持，指导