基于网络药理学和分子对接探讨天花粉治疗肺癌的作用机制

崔启迪 孙杉杉 陆梅 黄燕瑛 吕文文

1 滨州医学院附属医院肿瘤科，滨州 256603；2 滨州医学院附属医院药学部，滨州 256603

天花粉（radix trichosanthis）为葫芦科植物栝楼Trichosanthes kirilowii Maxim. 或双边栝楼Trichosanthes rosthornii Harms的干燥根，味甘、微苦，性微寒，归肺、胃经，具有清热泻火、生津止渴、消肿排脓的功效，可用于热病烦渴、肺热燥咳、内热消渴、疮疡肿毒的治疗［1］。研究表明，天花粉的有效成分主要包括蛋白质、淀粉、植物凝血素、多糖、皂苷等，具有抗肿瘤、引产抗孕、调节免疫、抗氧化、治疗缺血性脑损伤、降血糖、抗炎、抗病毒等作用［2-3］。肺癌是最常见的恶性肿瘤，直至2020年，中国新发肺癌病例数为82万例，死亡病例数为71 万例，均位于中国癌症新发病例和死亡病例首位［4］。肺癌现已成为我国发病率及病死率最高的恶性肿瘤，然而肺癌的治疗仍以手术治疗、放疗和化疗为主。肺癌发病机制复杂，传统治疗方法效果有限，不良反应明显［4］，寻求新的治疗方法迫在眉睫。中药因其治疗肿瘤的独特优势越来越受到重视，中医治疗肺癌的机制主要包括提高机体免疫功能、改善血流变学及微循环、抑制肿瘤新生血管形成和诱导肿瘤细胞分化和凋亡［5］。中医运用扶正祛邪法治疗肺癌1 例，肿块消除，3 个月后随访，未见复发［6］。周仲瑛教授从“复法大方”辨治肺癌1例，采用复法组合，多药杂呈，邪正兼顾，以缩小肿瘤、取得良效［7］。上述方法均取得明显效果，然而具体的作用机制尚不明确［6-7］。

网络药理学是以系统生物学的理论为基础，基于“疾病-基因-靶点-药物”相互作用网络，运用网络分析来系统综合地研究药物对疾病网络的干预与影响，由此展现出药物作用的一门新兴学科。网络药理学在方法学上的特点为集整体、动态、分析于一体，与中医的整体观和辨证论治的原则相一致，通过网络药理学的方法分析中药及其复方的多成分、多靶点、多途径协同作用［8］。本研究运用网络药理学的方法研究天花粉治疗肺癌的作用机制，同时为之后的实验以及临床应用奠定理论基础。

材料与方法

1.收集与筛选天花粉活性成分

检索时限为建库至2022年7月。在中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP）（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）［9］中检索“天花粉”，获得天花粉的化学成分，以化合物的药动力学参数中口服生物利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.18为筛选条件，筛选天花粉的有效活性成分。在中医药综合数据库（TCMID）（http：//47.100.169.139/tcmid/）［10］中检索“TIANHUAFEN”，得到天花粉化学成分后根据Lipinski 五规则方法进行筛选，Lipinski 五规则包括相对分子量小于500、脂水分配系数（ClogP）小于5、氢键给体数目小于5、氢键受体数目小于10、化合物中可旋转键的数量小于10［11-12］。查阅相关文献［13-15］，回收具有抗癌活性但因不符合条件而被删除的化学成分。

2.收集天花粉活性成分作用靶点

整理TCMSP 数据库中筛选出的活性化合物作用的靶点，运用Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）［16］将药物的靶蛋白名称转换为基因名，再将TCMID 数据库中筛选出来的活性成分所对应的靶点整理归纳。然后，利用PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）［17］获取天花粉所有活性成分的canonical SMILES 结构，将其输入SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction. ch/）［18］预测靶点，选取可能性（probability）＞0 并且可能性排名位于前15 的靶点。将3 种途径获取的靶点整合，去重。

3.收集肺癌疾病靶点

在GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）［19］、DrugBank 数据库（https：//www.drugbank.com/）［20］、人类孟德尔遗传综合数据库（OMIM）（https：//omim.org/）［21］和TTD 数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/）［22］中以“lung cancer”作为关键词进行搜索，得到肺癌相关靶点。将以上4 个数据库获得的靶点归纳整理并去重。

4.构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络

利用Venny 2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）［23］对肺癌疾病靶点和天花粉活性成分作用靶点取交集，获得交集基因，并绘制韦恩图。通过String 数据库（https：//cn.string-db.org/）［24］，选择Multiple Proteins 选项，Organism选择为Homo Sapiens，获得交集基因的蛋白互作网络，以TSV 格式保存文件并将其导入Cytoscape 3.8.2软件进行分析，以连接度（degree）值为依据筛选核心靶点。

5.基因本体（gene ontology，GO）和京都基因和基因组数据库（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析

运用Metascape 数据库（https：//metascape.org/gp/index.html）［25］对交集基因进行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。

6.构建“药物-靶点-通路-疾病”与“药物-化合物-交集靶点”网络

运用Cytoscape 3.8.2 软件，构建药物-靶点-通路-疾病网络。网络图中的节点分别代表药物、化合物、靶点、通路及疾病，连线表示节点间的相互作用。

7.分子对接验证

从PubChem 数据库中下载关键小分子化合物的3D 结构，保存为SDF格式，运用Open Babel软件转化为pdb格式；从蛋白质结构（PDB）数据库中下载核心靶点蛋白的3D 结构图，利用PyMOL 软件去水，去配体。运用AutoDock 软件进行分子对接，并用PyMOL软件将对接结果可视化。

结果

1.天花粉的活性成分

通过检索TCMSP 数据库，按照OB≥30%、DL≥0.18 条件进行筛选，得到2 种天花粉的活性成分，为菠菜甾醇（spinasterol）和仙人掌甾醇（schottenol）；查阅相关文献发现［13-15］，葫芦素B（cucurbitacin B）虽不符合筛选标准，但已被证实具有较好的抗肿瘤活性，因此，将该化学成分也纳入其中。见表1。检索TCMID 数据库，根据Lipinski 五规则筛选得到活性成分25种（表2）。共计得到28种活性成分。

表1 天花粉活性成分（TCMSP数据库）

表2 天花粉活性成分（TCMID）

2.活性成分作用靶点

通过SwissTargetPrediction数据库和TCMSP、TCMID数据库收集活性成分的靶点，一共获得314个靶点，去重后为201个。

3.肺癌疾病靶点

通过检索GeneCards 数据库，选取score≥20 分的靶点，得到798 个疾病靶点；检索OMIM、DrugBank 和TTD 数据库分别获得908、17和158个肺癌相关靶点。通过标准化并去重后共获得肺癌相关靶点1 645个。

4.PPI网络构建及核心靶点筛选

利用Venny 2.1 将获得的天花粉活性成分靶点与肺癌靶点取交集并绘制韦恩图，得到天花粉与肺癌共同靶点37 个（图1）。将交集靶点提交至String 平台，得到交集靶点的PPI 网络（图2）。将PPI 网络导入Cytoscape 软件进行分析，获得靶点degree 值。degree 表示靶点连接的边的数目，数值越大，说明该靶点在网络中的重要性越高。分析PPI网络中靶点degree值，计算出平均值为8.167，以degree值大于平均值为筛选条件，由此获得关键靶点共13 个（表3）。这些关键靶点可能在天花粉治疗肺癌中具有重要作用。

图1 天花粉（radix trichosanthis）治疗肺癌（lung cancer）交集靶点韦恩图

图2 天花粉治疗肺癌交集靶点蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络图

表3 天花粉治疗肺癌的关键靶点

5.GO和KEGG富集分析

将交集基因上传至Metascape 数据库进行GO 功能和KEGG 通路富集分析，设置显著性（P值）的界值为0.01，选择生物过程（Biological Processes）、分子功能（Molecular Functions）、细胞组成（Cellular Components）、KEGG 通路（KEGG Pathway）进行富集分析。将分析结果分别保存至Excel文件中，按照P值进行排序。

GO 功能富集分析结果显示，其主要参与的生物过程为腺体发育、细胞增殖的调控、分解代谢过程的负性调控、炎症反应、细胞对氧化应激的反应、细胞黏附的调节、细胞对白细胞介素6 的反应、DNA 损伤刺激反应的调节、白细胞迁移的负性调控、细胞内类固醇激素受体信号通路的调控、免疫系统过程的负性调控等；主要细胞组分即靶点所在的细胞位置为细胞质核周区、线粒体膜、核膜、转录调节复合物、轴突、膜筏等；主要分子功能为调控血红素结合、核受体活性、激酶结合、蛋白磷酸酶结合、激素结合、双加氧酶活性、蛋白质N 末端结合、电子转移活性、核受体结合、裂解酶活性、信号受体调节剂活性、肽酶活性等。见图3。count值代表富集在该生物过程或者功能上的基因数，count 值越大，富集的基因数目越多。

图3 天花粉治疗肺癌交集靶点基因本体（GO）富集分析

KEGG通路富集分析结果显示，天花粉治疗肺癌的靶点主要涉及化学致癌受体激活、癌症通路、缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路、表皮生长因子受体（EGFR）酪氨酸激酶抑制剂耐药、癌症中的微RNA、癌症中的蛋白聚糖、程序性死亡受体配体1（PD-L1）在癌症中的表达和程序性死亡受体1（PD-1）检查点通路等信号通路，依据P值选取排名前20 位的通路绘制气泡图，见图4。其中，圆点由小到大代表分值逐渐升高，靶点富集数目增多，通路显著性增强；颜色由蓝到红代表-log10（P-value）值逐渐增大，P值逐渐减小。

图4 天花粉治疗肺癌交集靶点京都基因和基因组数据库（KEGG）富集分析

6.“药物-靶点-通路-疾病”与“药物-化合物-交集靶点”网络构建

运用Cytoscape 3.8.2 构建天花粉治疗肺癌的药物-靶点-通路-疾病网络，药物、靶点、通路与疾病之间的相互网络见图5。其中绿色方形代表天花粉，蓝色圆形代表靶点，黄色菱形代表通路，红色方形代表疾病。利用Network Analyzer 插件对该网络进行拓扑分析，获得节点degree 值，根据degree 值判断节点在网络中的重要性，结果Chemical carcinogenesis - receptor activation 通路，BCL2 靶点和Pathways in cancer 通路的degree 值最高，分别为15、14、14，说明其在该生物网络中发挥了重要作用。

图5 天花粉治疗肺癌的药物-靶点-通路-疾病网络图

运用Cytoscape 3.8.2 软件构建天花粉的药物-化合物-交集靶点的网络图，见图6。其中红色方形代表天花粉，蓝色菱形代表化合物，橙色圆形代表靶点。对该网络进行拓扑分析，获得节点degree 值，发现仙人掌甾醇、菠菜甾醇的degree 值最高，为7，推测此2 种成分可能为天花粉治疗肺癌的关键小分子化合物。

图6 天花粉药物-化合物-交集靶点网络图

7.分子对接

将活性成分菠菜甾醇和仙人掌甾醇分别与核心靶点雌激素受体1（ER1）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、孕激素受体（PGR）、CXC 趋化因子配体8（CXCL8）、多聚腺苷酸转移酶1（PARP1）进行分子对接，AutoDock软件对接结果见表4。通常认为，蛋白质与化合物之间的结合能数值＜0，说明二者能够自发结合，结合能数值越低，二者的亲和力越强。分子对接结果显示，菠菜甾醇和仙人掌甾醇与蛋白的结合能均＜-7 kJ/mol，表明具有较好的结合活性。其中，2种活性成分与PARP1靶点的结合能最低，绘制对接模式图，见图7。

图7 天花粉活性成分与靶点分子对接模式图。A 为菠菜甾醇（spinasterol）与多聚腺苷酸转移酶1（PARP1）分子对接图；B 为仙人掌甾醇（schottenol）与PARP1分子对接图

表4 天花粉活性成分与靶点蛋白的分子对接结果

讨论

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤，发病率和病死率均居首位。天花粉是一种常见的中草药，应用广泛，且具有抗肿瘤的作用。研究表明，天花粉可抑制人恶性黑色素瘤A375 细胞的增殖和迁移［26］。天花粉蛋白能在体外显著抑制结直肠癌细胞增殖，促进凋亡［27］。天花粉多糖也可诱导人乳腺癌细胞凋亡［28］。此外，天花粉中的小分子化合物也具有抗肿瘤活性，其中邻苯二甲酸二丁酯（DBP）可显著抑制肺巨细胞癌细胞（PG 细胞）和人早幼粒白血病细胞（HL-60）的增殖，且都是通过诱导细胞凋亡来发挥作用［29］，其中的萜类化学成分葫芦素B 具有显著抗肿瘤作用，其通过抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制细胞迁移和侵袭、破坏细胞骨架、抗血管生成、诱导细胞衰老、改善肿瘤耐药等而发挥作用［30］。本研究采用网络药理学的方法初步探讨了中药天花粉治疗肺癌的作用机制。

通过构建交集靶点的蛋白互作网络，运用Cytoscape 3.8.2 软件进行拓扑分析发现ER1、STAT3、EGFR等为天花粉治疗肺癌的核心靶点。ER1 基因编码ERα，也称为NR3A1，是雌激素受体的2 种主要类型之一，ER 是由性激素雌激素激活的核受体。非小细胞肺癌细胞在细胞核和核外部位同时表达ERα 和ERβ，并且阻断其中任何一个都会导致细胞增殖显著减少［31-32］。STAT3 是一种原癌基因，是信号传导途径中重要的核转录因子，STAT3 与恶性肿瘤的发生有着密切关系。STAT3 参与了小细胞肺癌的发生发展，且STAT3可以直接激活血管内皮生长因子（VEGF）的表达［33］。STAT3 在非小细胞肺癌组织中高表达且持续激活，它的持续激活与肿瘤的增殖、分化、细胞凋亡、浸润转移等密切相关［34］。因此，STAT3与肺癌的发生发展密切相关，有望成为肺癌治疗的有效靶点。EGFR 作为上皮生长因子（EGF）细胞增殖和信号传导的受体，是人类表皮生长因子受体（HER）家族成员之一。EGFR在肿瘤的细胞增殖、血管生成、侵袭转移及抑制细胞凋亡中发挥重要作用。在非小细胞肺癌中，EGFR 基因突变广泛，与患者性别、年龄、吸烟史、病理类型等相关，且基因突变的患者靶向治疗效果显著［35］。

GO 和KEGG 富集分析结果显示，天花粉可作用于多种生物进程，进而影响肿瘤的发生发展过程，参与肺癌的治疗。PD-1/PD-L1 信号通路阻止T 细胞的增殖和扩散，导致肿瘤细胞免疫逃逸，进而促进肿瘤细胞生长［36］。HIF-1 是哺乳动物中广泛存在的转录因子，在缺氧状态下由血管生成，在肺癌中呈现高表达［37］。在低氧环境下，HIF-1α 通过磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）通路、热休克蛋白（HSP）90通路、促分裂原活化的蛋白激酶（MAPK）通路对肿瘤细胞的血管生成、增殖、侵袭、转移及凋亡进行调控［38］。

综上所述，运用网络药理学的研究方法分析天花粉治疗肺癌的有效成分及靶点，初步揭示了天花粉治疗肺癌的可能作用机制，为后续研究提供了参考，但本研究仍存在许多局限性，文中数据主要是利用数据库进行推测，其结论有待进一步实验研究加以验证。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献声明崔启迪：设计文章的思路与框架，绘制图表，撰写论文初稿；孙杉杉、陆梅：文献收集、整理和提炼；黄燕瑛：论文的修订；吕文文：论文终稿的审定，文章的质量控制及审校；崔启迪、吕文文：对文章整体负责，监督管理