植物精油降低反刍动物瘤胃甲烷产量的研究进展

张 奥 赵玉超 白萨茹拉 蒋林树*

(1.北京农学院动物科学技术学院,奶牛营养学北京市重点实验室,北京 102206;2.北京首农畜牧发展有限公司,北京 100076)

反刍动物瘤胃内微生物降解碳水化合物等营养物质,产生挥发性脂肪酸(VFA),合成微生物蛋白,为宿主提供能量和蛋白质。然而,瘤胃发酵过程中会产生甲烷,每年反刍动物甲烷排放量约占全球人为温室气体总排放量的16%[1]。甲烷不仅会加剧温室效应,还会造成饲料总能中2%～12%的能量损失[2]。因此,研究降低甲烷排放对提高反刍动物饲料效率和保护环境具有双重意义[3]。植物次生代谢物(如单宁、皂苷、精油和黄酮类化合物等)能够通过直接影响产甲烷古菌或间接破坏瘤胃原虫的生物膜来降低反刍动物瘤胃甲烷产量[4]。植物精油作为一种从植物中提取出来的具有挥发性和芳香性的植物次生代谢物,具有抗菌、抗炎和抗氧化等生物学功能[5],对降低反刍动物瘤胃甲烷产量有积极作用,具有作为天然甲烷抑制剂的潜力。本文着重对植物精油降低反刍动物瘤胃甲烷产量的研究进展进行综述,旨在为植物精油在动物生产中的科学应用提供参考,为降低反刍动物甲烷排放提供理论依据。

1 植物精油概述

植物精油是一种从植物中蒸馏提取出来的次生代谢物,在植物的根、茎、叶、花、果实和树皮中均有分布。根据生物合成途径,植物精油被分为萜类化合物和苯丙素类化合物[6],其中萜类化合物主要来源于脱氧木酮糖或甲羟戊酸代谢途径形成的乙酰辅酶A,如百里香酚、香芹酚和大蒜油等;苯丙素类化合物主要来源于莽草酸代谢途径合成的苯丙氨酸[7],苯丙素类化合物仅在肉桂、丁香和茴香中大量存在[8]。

植物精油具有良好的抗菌[9-11]、抗炎[12]、抗氧化[13]和抗病毒[14]等生物学功能,能够提高动物机体免疫力[15]、改善畜产品品质[16]、提升动物生产性能[17]等。植物精油在反刍动物生产中有着良好的应用效果,在羔羊饲粮添加牛至精油(0.3 g/kg DM)能够提高羔羊的免疫力和抗氧化能力,促进生长发育,改善瘤胃发酵和肉品质[18];在体外发酵液中加入100 mg/L的牛至精油能够提高绵羊对干物质(DM)、粗蛋白质(CP)和中性洗涤纤维(NDF)的消化率,改善瘤胃发酵,降低甲烷产量,但是添加量高于100 mg/L会对瘤胃微生物活性和瘤胃发酵产生抑制作用,降低饲料养分降解率[19-20];在肉羊饲粮中加入40 mg/kg沙葱精油能够提高干物质采食量(DMI)、平均日增重和料重比,有效改善肉羊的生长性能和屠宰性能,改善羊肉风味和营养价值[21-23];在荷斯坦犊牛饲粮中加入44.1 mg/kg DM混合植物精油可提高DM、CP、酸性洗涤纤维(ADF)、NDF、淀粉的全消化道消化率,对犊牛生长、瘤胃发育、肠道健康具有促进作用[24];在奶牛饲粮中加入150 mg/kg DM辣椒油树脂和丁香精油的混合精油能够提高乳脂率和产奶量,降低甲烷产量和强度,但对乳成分和血液指标没有显著影响[25-26];向溶血性支原体内加入0.025%的茴香精油和百里香精油后发现对其有抑制作用,可降低牛呼吸道疾病发病率[27];向奶牛乳腺内注射百里香精油和薰衣草精油能够抑制葡萄球菌和链球菌增殖,缓解奶牛乳腺炎[28];在奶牛饲粮中加入300 mg/kg DM柑橘精油能够降低牛奶中的不饱和脂肪酸含量,提高奶牛DMI、饲料效率、产奶量和乳脂产量[29];在肉牛饲粮中加入4 g/d的丁香精油和迷迭香精油的混合物可改善牛肉品质和嫩度,并且不会改变牛肉的脂肪厚度、大理石花纹、肌肉面积、化学成分和脂肪酸组成[30-31]。

2 植物精油降低瘤胃甲烷产量的机制

瘤胃是一个复杂的微生态系统,细菌、古菌和原虫等微生物相互作用促进饲料发酵,为宿主提供能量、蛋白质、维生素等[32]。甲烷是微生物发酵产生的副产物。

反刍动物瘤胃产生甲烷的过程如图1所示。反刍动物摄食后,饲粮中的营养物质(蛋白质、脂质和碳水化合物)被瘤胃微生物降解,产生二氧化碳(CO2)、氢气(H2)和VFA(包括乙酸、丙酸和丁酸等),产甲烷菌将这些初级发酵产物转化为甲烷。瘤胃产生甲烷的途径有3种:CO2-H2还原途径,利用甲酸、乙酸、丁酸等短链脂肪酸为底物的合成途径,以及利用甲醇、乙醇、甲胺和乙胺等甲基化合物为底物的合成途径[33],其中CO2-H2还原途径是瘤胃产生甲烷的主要途径[34]。碳水化合物在瘤胃中分解产生的一部分H2与CO2结合由产甲烷菌合成甲烷,进行一系列与ATP合成耦合的生化反应。另一部分H2被细菌、古菌和原虫等微生物利用生成VFA,即原虫利用淀粉、纤维素、半纤维素、果胶和可溶性糖产生VFA和代谢性H2,附着在其表面的古菌利用这些物质产生甲烷[4]。瘤胃中存在古菌和原虫之间的关联[35],古菌产生甲烷作为一种代谢策略,以获得其生长所需的能量[36]。因此,减少甲烷的合成可以通过抑制H2释放或促进其他途径消耗H2来实现。

图1 反刍动物瘤胃产生甲烷的过程

植物精油因其疏水性而对细菌的膜细胞有很高的亲和力,能够通过破坏膜蛋白来破坏细胞质膜,引起膜通透性增加,改变细胞构象,影响细菌的生长和活性,导致瘤胃菌群发生变化[37]。植物精油降低瘤胃甲烷产量可能涉及2种机制[38](图2):一是直接抑制产甲烷菌的生长,进而减少甲烷产生。例如,百里香精油或肉桂精油通过抑制奶牛瘤胃产甲烷菌生长,从而直接减少甲烷产量[39]。二是通过减少与产甲烷菌共生的细菌、古菌或原虫等微生物数量,间接减少甲烷产量。例如,在水牛饲粮中添加混合精油(青蒿油、柠檬草油和丁香油树脂)可以通过降低瘤胃古菌甲烷球菌(Methanococcus)和热原体(Thermoplasma)的相对丰度,间接影响甲烷产量[40]。以奶牛为瘤胃液供体,在体外发酵液中添加500 mg/L的肉桂油以及1 500 mg/L的肉桂油和留兰香油均能通过降低发酵液中的原虫数量间接减少甲烷产量[41]。除此之外,也有2种机制同时发生的情况,如牛至精油对绵羊瘤胃甲烷产量的抑制,一方面是通过抑制产甲烷菌的生长,从而降低甲烷产量;另一方面是通过降低厚壁菌门(Firmicutes)、月形单胞菌属(Selenomonas)和光冈菌属(Mitsuokella)的相对丰度和增加普雷沃氏菌属(Prevotella)、戴阿利斯特杆菌属(Dialister)和乳杆菌属(Lactobacillus)的相对丰度影响瘤胃细菌群落,从而抑制甲烷产生[42],这与Paraskevakis[43]得出的希腊牛至精油降低山羊瘤胃甲烷产量的机制一致。

图2 植物精油降低瘤胃甲烷产量的作用机制

3 植物精油降低瘤胃甲烷产量的效果

3.1 体外试验研究

近年来,大量体外试验结果表明植物精油能够降低瘤胃甲烷产量(表1)。曹玉伟等[44]以绵羊为瘤胃液供体进行体外模拟瘤胃发酵,发现添加400 mg/L的香芹酚对甲烷产量具有抑制作用,同时还会导致总挥发性脂肪酸(TVFA)和丙酸浓度降低,而添加50、100或200 mg/L的香芹酚对甲烷产量无显著影响。李艳玲等[45]的试验发现,在肉羊体外发酵液中添加400 mg/L的香芹酚或百里香酚可以显著降低甲烷产量,改变了瘤胃发酵模式并抑制了瘤胃微生物活性,该试验结果与曹玉伟等[44]的试验结果一致;该试验还发现,添加100和200 mg/L的香芹酚或百里香酚可以显著增加瘤胃甲烷产量,促进了瘤胃发酵。以上体外试验的结果说明,植物精油降低瘤胃甲烷产量的效果与植物精油的添加量密切相关。

表1 植物精油对瘤胃甲烷产量的影响(体外试验研究)

植物精油降低瘤胃甲烷产量的效果还与瘤胃液供体动物的种类有关。张然等[46]以新疆细毛羊与杜泊羊杂交的公羊为瘤胃液供体,发现在发酵液中添加300或400 mg/L的牛至精油可以显著降低甲烷产量,而添加100或200 mg/L的牛至精油则对甲烷产量无显著影响。同样是研究牛至精油对公羊瘤胃发酵的影响,Zhou等[42]的瘤胃液供体选取的是德国美利奴羊与地方绵羊杂交的公羊,在体外发酵液中加入91或130 mg/L牛至精油时,甲烷产量显著下降;同时,通过16S rRNA测序发现,Prevotella和Dialister的相对丰度增加,说明添加牛至精油可以通过改变瘤胃细菌群落来改变瘤胃发酵,从而改变VFA组成并减少甲烷排放。体外添加相近浓度的同种植物精油的试验结果不一致,其原因可能是由于瘤胃液供体动物种类不同,也可能是由于基础饲粮组成不同所致。张然等[46]的试验基础饲粮以44.26%的羊草、22.95%苜蓿干草、10.19%小麦麸为主,而Zhou等[42]的试验基础饲粮以65.50%青贮玉米和25.74%玉米为主,基础饲粮组成不同可能会影响植物精油的作用效果。张然等[46]的试验中添加100或200 mg/L的牛至精油对瘤胃甲烷产量无显著影响,可能是由于低剂量下瘤胃微生物对植物精油产生了耐受性。Evans等[47]研究表明,高浓度的牛至精油可以促进革兰氏阳性菌的生成,从而增加乙酸比例,同时能够抑制革兰氏阴性菌的生成,从而降低丙酸比例,使乙丙比升高,这表明植物精油对于瘤胃内菌群的抑制具有选择性。

此外,植物精油降低瘤胃甲烷产量还与发酵体系中的底物有关。李嘉秋[48]以湖羊为瘤胃液供体,通过体外产气试验发现添加0.8 mL/L的柚皮精油能够使甲烷产量下降,但在不同底物下柚皮精油对瘤胃发酵产生的影响不同,当底物为玉米时,发酵液中乙酸浓度下降,H2产量上升,瘤胃球菌属1(Ruminococcus1)、链球菌属(Streptococcus)和口腔杆菌属(Oribacterium)的相对丰度增加,密螺旋体属2(Treponema2)和琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)的相对丰度减少;当底物为羊草时,发酵液中乙酸、丙酸、丁酸浓度和H2产量下降,Treponema2和普雷沃氏菌属1(Prevotella1)的相对丰度减少,Succinivibrio、Ruminococcus1、欧尔森氏菌属(Olsenella)和瘤胃球菌属2(Ruminococcus2)的相对丰度均增加,这说明柚皮精油对瘤胃微生物具有选择性压力,不同底物下,响应和耐受柚皮精油的微生物不同,对瘤胃发酵与甲烷代谢产生的影响也不同。

不同种类的植物精油对同一品种的动物瘤胃甲烷产量的影响也不一致。同样都是以荷斯坦奶牛为瘤胃液供体进行体外试验,加入0.16 g/d的肉桂酸(肉桂醛和大蒜油的商业混合物)能够降低甲烷产量,具体机制可能是肉桂酸通过降低原虫总数和NDF消化率,从而影响瘤胃发酵[49];加入90 μg/g的广麝香精油能够降低乙酸和NH3-N浓度,同时还能降低原虫总数、提高丙酸浓度并降低甲烷产量,原虫是瘤胃内NH3-N的净生成微生物,通过降低瘤胃内原虫总数能够降低NH3-N浓度,甲烷产量下降可能是由于用来合成甲烷的H2转为合成丙酸[50-52]。将百里酚和香芹酚以6种比例(100∶0、80∶20、60∶40、40∶60、20∶80和0∶100)组合后加入到发酵液中,发现总细菌数量下降,而甲烷产量均无显著变化,产甲烷菌种群仅发生轻微变化[53]。Günal等[54]的研究表明,加入相同剂量、不同种类的植物精油对于抑制奶牛体外瘤胃甲烷生成的效果也不同,丁香油、白百里香油和茴香油都可以显著降低甲烷产量,这可能是由于这些植物精油抑制了产甲烷菌的生长,同时还发现,不同浓度下植物精油对瘤胃发酵指标的影响也不一致,低剂量(125 mg/L)下植物精油(茴香油或白百里香油)对甲烷排放没有显著抑制作用,这可能与饲粮的基本营养成分或植物精油对某些微生物的选择性有关。低剂量下的植物精油可以通过淀粉水解抑制非结构性碳水化合物的消化,而不影响纤维的消化[55]。Evans等[47]的试验表明,90 mg/L的百里香酚能够有选择性地抑制反刍月形单胞菌的生长,但不抑制牛链球菌的生长,而400 mg/L的百里香酚则会抑制体外瘤胃内所有微生物的生长。

3.2 体内试验研究

目前,有关植物精油降低瘤胃甲烷产量的研究大多集中于体外试验,体内试验较少,将体外试验的结果类推到体内试验的条件有局限性[56]。由于植物精油的种类、添加量以及动物饲粮组成和营养水平不同,体内试验往往会出现不同的结论,因此很难确定各种植物精油的最佳有效添加量[8]。尽管体外试验有助于筛选植物精油及其成分的抗菌活性并预测适宜的添加量,但必须在体内评估这些植物精油对调控瘤胃功能的实际作用效果[57]。尽管所报道的体内试验有限,但也有部分试验表明植物精油能够降低反刍动物瘤胃甲烷产量(表2)。Choi等[58]研究发现,1 g/d红松球果精油降低了山羊瘤胃内甲烷产量,并且降低了瘤胃内真菌丰度和瘤胃原核微生物群的均匀度,但产甲烷菌丰度变化不大,一种原因可能是由于真菌丰度的降低限制了H2的可用性,导致产甲烷菌生产的甲烷量减少,另一种原因可能是主要产氢菌的丰度下降,产甲烷菌将更多的能量用于宿主生长与维持需要,减少了能量浪费。

表2 植物精油对瘤胃甲烷产量的影响(体内试验结果)

Kala等[40]的研究显示,在水牛饲粮中加入0.75或1.5 mL/kg的混合植物精油(青蒿油、柠檬草油和丁香油树脂按比例混合制成)能够降低瘤胃内古菌甲烷球菌属(Methanococcus)和热原体属(Thermoplasma)的相对丰度,但未能显著降低甲烷产量。同样是以水牛为试验对象,Pawar等[59]的研究发现,饲粮中添加2 g/d的黄杨籽油或肉桂叶油均能降低水牛瘤胃甲烷产量,并且极显著降低瘤胃NH3-N和乳酸浓度,同时羧甲基纤维素酶活性显著升高,蛋白酶活性极显著降低,但木聚糖酶、抗逆转录酶和乙酰酯酶活性不受影响;此外,通过16S rRNA测序发现,饲粮中添加2 g/d的黄杨籽油或肉桂叶油后瘤胃内产甲烷菌和产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes)的相对丰度降低,原虫总数显著减少。唐炜轩等[60]的研究显示,在肉羊饲粮中添加500 mg/d的桉叶油或茴香油能够降低瘤胃甲烷短杆菌(Methanobrevibacterruminantium)的相对丰度,增加Methanobrevibactereuryarchaeote的相对丰度;尽管2种植物精油对产甲烷菌都有作用,但对肉羊瘤胃甲烷产量影响却不同,添加500 mg/d的茴香油有降低甲烷产量的趋势,而添加500 mg/d的桉叶油对甲烷产量无显著影响,这可能是由于植物精油的添加量低,未达到发挥作用的程度,也可能是由于添加植物精油的时间过长,瘤胃微生物产生适应性。

尽管部分体外试验表明牛至精油和香芹酚等植物精油能够降低瘤胃甲烷产量,但在体内试验中并未得到积极的效果。Benchaar[61-62]研究发现,在奶牛饲粮中添加50 mg/kg的肉桂油、肉桂醛、牛至精油或香芹酚对瘤胃甲烷产量均无显著影响,且对瘤胃发酵参数均没有显著影响,这与添加植物精油后对DMI、瘤胃消化和营养物质全消化道表观消化率没有显著影响是一致的;此外,对瘤胃NH3-N浓度和原虫总数也没有显著影响,这与支链VFA(异丁酸和异戊酸的总和)摩尔比没有变化是一致的。Kolling等[63]和Olijhoek等[64]的体内试验结果均表明,饲粮中添加0.3、0.56、0.6或0.9 g/kg的牛至精油均未降低奶牛的甲烷产量,并且瘤胃发酵参数、瘤胃微生物或产奶性能均没有发生显著变化。因此,体外试验数据并不能完全代表体内结果,仍需要进行大量动物试验来确定植物精油能够降低反刍动物瘤胃甲烷产量的有效成分、最佳添加量和作用机制等。

4 植物精油作为瘤胃甲烷抑制剂的挑战与展望

尽管有大量试验已经证明植物精油能够降低反刍动物瘤胃甲烷产量,但未来要将植物精油广泛应用到实践生产中,仍面临多种挑战。

首先,植物精油在体外的研究远多于动物体内,其能够降低瘤胃甲烷产量的最佳添加量尚不明确,并且植物精油降低瘤胃甲烷产量是非特异性的,可能会产生一些不良反应[8],如可能会导致乳脂率下降[65]等。Yadeghari等[66]通过体外试验评估了薰衣草精油对体外瘤胃发酵和甲烷产量的剂量反应效应,表明薰衣草精油的剂量对瘤胃发酵具有选择性依赖作用,低剂量(250 μL/L)和中剂量(500 μL/L)的薰衣草精油能够促进瘤胃发酵,而高剂量(750和1 000 μL/L)的薰衣草精油会抑制瘤胃发酵。Jiménez-Ocampo等[67]研究了橙精油对饲喂百慕大干草的小母牛瘤胃甲烷产量的影响,发现体内试验与体外试验结果并不一致,体外试验结果表明添加0.25%的橙精油能够降低瘤胃甲烷产量,但当添加剂量达到0.5%时会增加瘤胃甲烷产量,原因可能是因为高浓度的橙精油对瘤胃微生物群产生了毒性,而体内试验结果表明橙精油添加剂量为0.5%时能够降低瘤胃甲烷产量,这之间的差异可能是因为与体内试验相比,体外试验缺乏对VFA的吸收,以及瘤胃内微生物种群组成存在差异。因此,未来仍需进一步通过体内试验来确定植物精油能够产生效果的最佳添加量,并且也要注意减少或消除使用植物精油带来的不良反应。

其次,有关植物精油在动物不同生长阶段的作用的研究较少,瘤胃微生物对植物精油的耐受性和适应机制仍不清楚。反刍动物在不同的生长阶段所需营养不同,饲粮结构和饲养管理不同,植物精油发挥作用的效果也会不同。例如,在奶牛饲粮中添加1 g/d的混合植物精油(丁子香酚和乙酸香叶酯为主要化合物)能够降低经产奶牛每千克产奶量的甲烷排放强度,而对初产奶牛则没有显著影响[68]。此外,有关长期使用植物精油的有效性和稳定性,以及长期使用植物精油对反刍动物的影响等缺乏研究[69]。瘤胃微生物可以适应植物化学物质,这可能使添加植物精油后瘤胃甲烷产量的减少只是一种短暂的反应[70]。例如,在湖羊饲粮中添加0.8 mL/L的柚皮精油可以显著降低甲烷产量,但随着时间推移,作用效果会减退,甲烷产量在2周后再度上升,但低于初始水平[48]。这说明要保持瘤胃菌群对植物精油的敏感性,或可以采用间歇性饲喂植物精油。未来应针对长期使用植物精油而产生的耐受性如何解决,是否需要改变植物精油种类或添加量,如何有效采用间歇性饲喂等开展进一步研究。

再次,对植物精油的有效成分尚未确定,有关混合植物精油之中的不同植物精油之间的相互影响也缺乏大量研究,这对研究植物精油的最佳剂量和最佳组合产生了阻碍[71]。植物精油在不同发酵底物下发挥作用效果不同,这与其化学成分有关。在低剂量(30 μL/L)下,Lippiaturbinata精油降低甲烷产量效果更好;在高剂量(300 μL/L)下,Tagetesminuta精油对不同发酵底物中纤维消化率的抑制作用比Lippiaturbinata精油大1.51倍;Lippiaturbinata和Tagetesminuta精油这2种植物精油的作用效果不同可能与其化学组成的差异有关,Lippiaturbinata精油的含氧萜烯占总成分不到30%,而Tagetesminuta精油的含氧萜烯几乎占到90%[72]。植物精油减少瘤胃甲烷产生的有效性取决于发酵底物与在发酵介质中产生不同特性(如pH)的添加剂量之间的相互作用,植物精油的化学性质调节了这种反应的强度[73]。另外,每种植物精油中存在的活性成分及其不同的组合会产生不同的拮抗或协同效应,这会改变它们对瘤胃微生物的作用方式,影响作用效果[74]。例如,在饲粮中添加牛至精油和莫能菌素对1岁荷斯坦公牛的生长性能有拮抗作用[75],同时富马酸二钠和百里香精油混合使用比单独使用时降低甲烷产量效果更好,并且还能提高饲料利用率,说明富马酸二钠和百里香精油之间存在协同效应[76]。未来的研究中需要重点关注植物精油在反刍动物应用中发挥作用的有效成分,以便确定植物精油的最佳剂量和最佳组合。

最后,目前植物精油的提取工艺不完善、制备成本高,这是制约植物精油在畜牧生产中广泛应用的主要瓶颈之一。植物精油传统的提取方法包括压榨法、水蒸气蒸馏法、有机溶剂萃取法等,但随着科技的进步,现阶段出现了更多新型的提取方法,包括超临界流体萃取法、固相微萃取法、无溶剂微波提取法、酶提取法、超声辅助提取技术和分子蒸馏法等[77]。其中,在商业上应用最多的是水蒸气蒸馏法,其优势在于简单方便、成本较低,但存在着效率低下、受外界环境影响大和污染环境等弊端[78]。现阶段更多的试验人员开始尝试使用新型提取工艺,使效率更高,污染更小,但提取纯化的成本高,难以普及,制约了植物精油在畜牧生产中的广泛应用。未来应将解决植物精油的提取工艺问题列为重点研究方向,降低生产成本,优化提取工艺,减少残留问题,尽快将新型提取工艺广泛应用到实际生产中。

总之,未来需开展大量体内外试验来确定植物精油发挥作用的最佳剂量、有效成分以及作用机制,并进一步研究长期使用植物精油而产生的耐受性问题和不良影响,还应将解决植物精油的提取工艺问题也列为重点研究方向,降低生产成本,优化提取工艺,减少残留问题,尽快将新型提取工艺广泛应用到实际生产中。

5 小 结

植物精油具有降低反刍动物瘤胃甲烷产量的潜力,但要将植物精油作为甲烷抑制剂广泛应用到实践生产中,仍面临巨大挑战。一方面,要进行大量体外试验,筛选出能够降低甲烷产生的植物精油种类及其添加量;另一方面,要进行大量体内试验,广泛验证能够发挥作用的植物精油的有效成分和最佳添加量。同时,还应探究不同植物精油之间的相互作用,进一步明确长期使用植物精油的有效性、稳定性和适应性,降低生产成本,优化提取工艺,为开发新型绿色瘤胃甲烷抑制剂提供科学支撑。