化瘀祛斑胶囊60Co-γ 射线辐照灭菌剂量的探究

★ 刘峰 王前 吴建雄 薛阳 何枢衡 （合肥亿帆生物制药有限公司 合肥 231201）

化瘀祛斑胶囊为《中国药典》记载的中药品种，功能主治为疏风清热、活血化瘀。处方由柴胡、薄荷、黄芩、红花、当归、赤芍组成，用于黄褐斑、酒渣、粉刺的治疗。其中柴胡、薄荷、当归为生粉入药，成品制备工序较多，工艺繁琐。生产过程微生物滋生问题突出，因此需对成品进行灭菌［1］。药品常用灭菌方式有湿热灭菌、干热灭菌、过滤灭菌、60Co-γ 射线辐照灭菌等［2］。由于柴胡、当归、薄荷中含有大量挥发性药效成分，不适宜加热灭菌。60Co-γ 射线辐照灭菌具有无需加热、穿透力强、灭菌效果好等优势［3］。但辐照灭菌可能会对产品的稳定性和物质基础产生影响［4-5］。故本研究建立化瘀祛斑胶囊特征图谱，采用特征峰数量、相对保留时间和特征图谱相似度对不同60Co-γ 射线辐照量剂量（0、3、6、9 kGy）灭菌的化瘀祛斑胶囊进行对比，结合微生物限度检查和黄芩苷含量测定综合分析，确定化瘀祛斑胶囊60Co-γ 射线的辐照剂量。

1 仪器设备与试剂试药

1.1 仪器设备

Agilent 1260 高效液相色谱仪（安捷伦公司）；KQ-250DB 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；ME204 电子分析天平（梅特勒托利多公司）；MS105DU 电子分析天平（梅特勒托利多公司）；BFT-IV 型辐照设备（北京比尼公司）。

1.2 试剂试药

羟基红花黄色素A（批号111637-202111，纯度96.8%）、没食子酸（批号110831-201906，纯度91.5%）、芍药苷（ 批号110736-202145，纯度94.6%）、阿魏酸（ 批号110773-201915，纯度99.4%）、迷迭香酸（批号111871-202007，纯度98.1%）、黄芩苷（ 批号110715-202223，纯度97.2%）、汉黄芩苷（批号112002-201702，纯度98.5%）、黄芩素（批号111595-201607，纯度98.5%）、汉黄芩素（批号111514-201706，纯度100%），均购自中国食品药品检定研究院。乙腈（HPLC，TEDIA 公司）；无水甲醇（分析纯，国药集团股份有限公司）；磷酸（HPLC，阿拉丁公司）；纯化水（娃哈哈集团有限公司）。化瘀祛斑胶囊（批号210801、211201、211202、211203、220201、220202、220901、220902、230201、230202，天长亿帆制药有限公司）。

2 方法与结果

2.1 灭菌方法

将化瘀祛斑胶囊成品包装成箱，每箱120 盒，平放于辐照箱内。采用BFT-IV 型辐照装置对化瘀祛斑胶囊进行60Co-γ 射线辐照灭菌，灭菌剂量分别为3、6、9 kGy。未灭菌和低中高辐照剂量（3、6、9 kGy）灭菌后的化瘀祛斑胶囊批号分别为：230513-01、230513-02、230513-03、230513-04。

2.2 辐照灭菌样品微生物限度检查

按照《中国药典》2020 年版四部通则1105（微生物计数法）和通则1106（控制菌检查法）检查样品微生物。按照通则1107（非无菌药品微生物限度标准），非无菌固体制剂细菌总数应<103个、霉菌和酵母菌总数应<102个、不得检出大肠埃希菌（1 g）。上述4 批微生物限度检查结果见表1。结果，未灭菌的化瘀祛斑胶囊微生物超限度，低、中、高辐照剂量灭菌后的化瘀祛斑胶囊微生物限度检查均合格。

表1 不同辐照剂量灭菌的化瘀祛斑胶囊微生物限度检查结果

2.3 辐照灭菌样品黄芩苷含量测定

按照《中国药典》2020 年版一部化瘀祛斑胶囊的黄芩含量测定项对不同辐照剂量灭菌后的化瘀祛斑胶囊进行黄芩苷含量测定。结果，未灭菌的化瘀祛斑胶囊和低、中、高辐照剂量灭菌后的化瘀祛斑胶囊黄芩苷含量基本一致。见表2。

表2 不同辐照剂量灭菌的化瘀祛斑胶囊黄芩苷含量测定结果

2.4 特征图谱研究

2.4.1 色谱条件 色谱柱：Welch Xtimate C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈（A）-0.05%磷酸水溶液（B）梯度洗脱，洗脱程序为0～2 min:2%（A），2～5 min:2%→15%（A），5～10 min:15%→19%（A），10～20 min:19%（A），20～25 min:19% →24%（A），25～35 min:24%（A），35～40 min:24% →27%（A），40～50 min:27%→45%（A），50～60 min:45%→60%（A），60～65 min:60% →65%（A），65～65.1 min:65%→90%（A），65.1～75 min：90%→90%（A）；流速：1.0 mL/min；检测波长为240 nm；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。

2.4.2 对照品溶液的制备 分别取羟基红花黄色素A、没食子酸、芍药苷、阿魏酸、迷迭香酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素对照品适量，加甲醇制成每1 mL 约含50 μg 的混合对照品溶液。

2.4.3 供试品溶液的制备 取化瘀祛斑胶囊样品约0.5 g，精密称定，精密加入70%甲醇25 mL，超声处理（300 W，40 kHz）30 min，放冷，滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 特征图谱方法学考察

2.4.4.1 精密度试验 取230202 批化瘀祛斑胶囊供试品溶液，连续进样6 次进行测定。以黄芩苷为参照峰，计算特征图谱中各特征峰的相对保留时间和相对峰面积。结果12 个特征峰的相对保留时间RSD<1.0%，相对峰面积RSD<2.0%，表明仪器精密度良好。

2.4.4.2 稳定性试验 取230202 批化瘀祛斑胶囊供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 进样测定特征图谱。以黄芩苷为参照峰，计算特征图谱中各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果12 个特征峰的相对保留时间RSD<1.0%，相对峰面积RSD<2.0%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.4.3 重复性试验 取230202 批化瘀祛斑胶囊6 份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。以黄芩苷为参照峰，计算特征图谱中各特征峰的相对保留时间及相对峰面积。结果12 个特征峰的相对保留时间RSD<1.0%，相对峰面积RSD<2.0%，表明该方法重复性良好。

2.4.4.4 对照特征图谱的生成及特征峰指认 取10 批化瘀祛斑胶囊（批号210801、211201、211202、211203、220201、220202、220901、220902、230201、230202），按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。将10 批供试品色谱图导入“中药指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）软件进行分析，采用Mark 峰匹配，生成化瘀祛斑胶囊对照特征图谱。根据单位饮片制剂供试品色谱图和对照品色谱图，指认了13 个特征峰。10 批供试品色谱图和对照特征图谱见图1、图2。其中8 号峰黄芩苷出峰时间适中，峰面积较大，选为S 峰。

图1 10批供试品色谱图

图2 化瘀祛斑胶囊对照特征图谱及峰指认图

2.4.4.5 辐照灭菌样品与对照特征图谱对比分析 取上述4 批化瘀祛斑胶囊，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。将4 批供试品色谱图和对照特征图谱导入“中药指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）软件进行分析，计算相似度均大于0.99。4 批化瘀祛斑胶囊特征图谱与对照特征图谱的叠加图见图3。结果不同辐照剂量化瘀祛斑胶囊特征图谱与对照特征图谱的相似度、特征峰数量和特征峰相对保留时间差异均无统计学意义（P>0.05）。表明低、中、高不同剂量辐照灭菌后的化瘀祛斑胶囊与未灭菌的化瘀祛斑胶囊质量无明显差异。

图3 不同辐照剂量的化瘀祛斑胶囊色谱图与对照特征图谱的叠加图

2.5 辐照灭菌样品稳定性考察

将低、中、高辐照剂量灭菌的化瘀祛斑胶囊置40 ℃，75%RH 条件下放置3 个月后，按“2.4.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。将试品色谱图和对照特征图谱导入“中药指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）软件进行分析，计算相似度均大于0.99。同时检测稳定性样品的黄芩苷含量和微生物限度。结果，低、中、高辐照剂量灭菌的化瘀祛斑胶囊置40 ℃，75%RH 条件下放置3 个月后，整体化学成分无明显变化，黄芩苷含量无明显变化，无微生物滋生。稳定性样品黄芩苷含量测定结果和微生物限度检查结果见表3 和表4。

表3 稳定性样品黄芩苷含量测定结果表

表4 稳定性样品微生物限度检查结果表

2.6 化瘀祛斑胶囊最佳灭菌剂量确定

综合对不同辐照剂量灭菌的化瘀祛斑胶囊的特征图谱分析、微生物限度检查和黄芩苷含量测定，最终确定最佳辐照剂量为6 kGy。

3 讨论

化瘀祛斑胶囊是由薄荷、当归、柴胡混合细粉与处方其他药味的水提浸膏制得的中成药，所含有效活性成分多样复杂。60Co-γ 射线辐照灭菌的穿透力强，灭菌效果好，但是可能会对产品的稳定性和物质基础产生影响。研究者采用《中国药典》微生物检查方法评价灭菌后样品的微生物负载符合要求。化瘀祛斑胶囊药品标准的黄芩苷含量测定方法仅可评价样品中黄芩苷一项指标，无法评价60Co-γ射线辐照灭菌对化瘀祛斑胶囊整体质量的影响。研究者建立了化瘀祛斑胶囊特征图谱，指认了13 个特征峰，13 个特征峰分别归属于化瘀祛斑胶囊处方药味柴胡、薄荷、黄芩、红花、当归、赤芍。其中没食子酸、羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、迷迭香酸、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素均是重要的药物活性成分，化瘀祛斑胶囊特征图谱可以较全面地评价化瘀祛斑胶囊的质量。通过辐照灭菌前后化瘀祛斑胶囊特征图谱对比，确定辐照灭菌未对化瘀祛斑胶囊的质量产生明显影响。

根据原国家卫生部发布的《60Co 辐照中药灭菌剂量标准》（内部试行）和国家药品监督管理局审评中心发布的《中药辐照灭菌技术指导原则》，中药60Co-γ 射线辐照灭菌的剂量应不高于10 kGy。因此研究者确定化瘀祛斑胶囊60Co-γ 射线辐照较佳的剂量为6 kGy。