蛋白酶N1对小鼠心肌细胞增殖的作用及机制

赵宗磊，陈颂歌，孙锁峰，王丽霞

(河南省人民医院心内科,河南 郑州 450000)

近年来,心肌梗死及其导致的心力衰竭发病率逐年上升[1]。心肌细胞受损后增殖能力明显降低,有研究发现,靶向内源性基因可促进心肌细胞原位增殖,促进心肌细胞再生,进而改善心肌梗死后心功能[2]。蛋白酶N1(protein kinase N1,PKN1)是一种应激反应蛋白激酶,是磷酸鸟苷结合蛋白的下游作用靶点[3]。PKN1可发挥信号传导作用,其活性异常与多种人类疾病及其病理发展过程密切相关,如肌萎缩性脊髓侧索硬化症及动脉损伤后再狭窄[4-5]。有研究表明,PKN1在心脏中起保护作用,干扰PKN1表达可抑制心肌细胞收缩功能[6-7]。然而,PKN1对心肌细胞增殖的作用及机制目前尚不清楚。本研究旨在探讨PKN1对小鼠心肌细胞增殖的作用及机制,以期为心肌细胞增殖的调控提供新的靶点,为心肌梗死后心肌损伤的治疗提供研究方向。

1 材料与方法

1.1 实验动物

12只健康1日龄C57BL/6雄性小鼠乳鼠,无特定病原级,体质量(4.0±0.2)g,购自郑州大学医学检验动物中心。所有动物实验均获得河南省人民医院动物研究委员会的批准。

1.2 主要试剂与仪器

动物用异氟烷购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司,PKN1干扰片段及对照片段购自广州锐博生物技术有限公司,PKN1干扰腺病毒及空载腺病毒购自汉恒生物科技(上海)有限公司,胰蛋白酶、青霉素和链霉素、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbeco′s modified Eagle′s medium,DMEM)、胎牛血清购自美国Gibco公司,PKN1抗体、心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)抗体、Ki-67抗体、cyclin D1抗体购自英国Abcam公司,β-actin抗体、山羊抗小鼠二抗、山羊抗兔二抗购自上海普迈生物科技有限公司,RNA反转录试剂盒购自日本TaKaRa公司,RNA提取试剂盒、SYBRs Premix Ex TaqTM试剂盒购自宝生物工程 (大连) 有限公司;荧光定量聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)仪购自瑞士Roche公司,荧光共聚焦显微镜购自德国Carl Zeiss公司,电泳槽、电转膜装置购自美国Bio-Rad公司,细胞培养箱、低温高速离心机、冰冻切片机购自美国Thermo Fisher公司;所有引物均由生工生物工程(上海)有限公司设计合成。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠心肌细胞分离培养及分组

使用异氟烷麻醉1日龄小鼠2只,分离心室并切成小块,用胰蛋白酶37 ℃消化2次,每次消化15 min,离心后收集细胞沉淀。将细胞沉淀重悬于含体积分数10%胎牛血清、青霉素和链霉素的DMEM中,培养于100 mm细胞培养皿中,置于37 ℃、含体积分数5%CO2细胞培养箱中培养2 h。孵育2 h后,收集上清液中的小鼠心肌细胞,并接种于6 cm细胞培养皿,分为对照组和干扰组,每组5个细胞培养皿。干扰组心肌细胞转染PKN1干扰片段,对照组细胞转染对照片段,转染6 h后更换培养基,继续培养24 h后收集细胞进行后续实验。

1.3.2 动物分组与处理

按照随机数字表法将10只小鼠分为正常组和观察组,每组5只。观察组小鼠于心脏原位注射 PKN1干扰腺病毒(1×109PFU),正常组小鼠于心脏原位注射空载腺病毒(1×109PFU),由母鼠喂养至7 d后进行后续实验。

1.3.3 免疫荧光法检测小鼠心肌细胞增殖能力

取对照组和干扰组心肌细胞,吸去培养基,磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)洗涤3次,多聚甲醛固定30 min,Triton 破膜后,滴加含体积分数1%牛血清白蛋白的PBS封闭60 min,滴加细胞增殖核抗原Ki-67一抗,室温下孵育2 h,吸去一抗,PBS洗涤3次,滴加山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗,室温下孵育1 h,吸去二抗,PBS洗涤3次,加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染液孵育15 min,使用PBS溶液洗涤,将染色完成的心肌细胞置于共聚焦显微镜下进行图像采集。

取正常组和观察组小鼠,分离心脏组织,PBS洗涤3次,将心脏组织置于冰冻切片包埋盒中,加入冰冻包埋剂置于-20 ℃中包埋固定。使用冰冻切片机将心脏组织切片(厚3.5 μm),并将心脏组织切片贴于玻璃载玻片中,加入多聚甲醛固定30 min,加入Triton 破膜,滴加含体积分数1%牛血清白蛋白的PBS封闭60 min,滴加细胞增殖核抗原Ki-67一抗,室温下孵育2 h,吸去一抗,PBS洗涤3次,滴加山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗,室温下孵育1 h,吸去二抗,PBS洗涤3次,加入DAPI染液孵育15 min,使用PBS洗涤后用甘油封片,将染色完成的心肌组织切片置于共聚焦显微镜下进行图像采集。

共聚焦显微镜下可见心肌细胞核被DAPI染成蓝色,心肌细胞中心肌结构蛋白 cTnT 阳性表达显示为绿色荧光,心肌细胞核中Ki-67阳性表达显示为红色荧光。每个样本随机选取3个视野,视野中Ki-67阳性表达的心肌细胞数与视野中全部心肌细胞数的比值为Ki-67阳性表达率,取均值。Ki-67阳性表达率越高表示细胞增殖能力越强。

1.3.4 实时荧光定量PCR法检测对照组和干扰组心肌细胞中PKN1 mRNA表达

取对照组和干扰组心肌细胞,根据RNA提取试剂盒说明书提取心肌细胞总RNA。取1 μg总RNA,使用RNA反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA,严格按照试剂盒说明书进行操作。使用实时荧光定量PCR仪进行实时定量PCR,反应体系:SYBRs Premix Ex Taq 5 μL、上下游引物各 0.2 μL、cDNA 1.0 μL、ddH2O 3.6 μL;反应条件: 95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s,60 ℃ 退火/延伸 30 s, 共40个循环。PKN1上游引物序列为 5′-AAGCGATGCTACCCAATC-3′,下游引物序列为5′-GCTCTACGGCTCCCAGTT-3′;β-tubulin上游引物序列为5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′,下游引物序列为5′-TTGATGTCACGCACGATTTCC-3′。以β-tubulin为内参基因,采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

1.3.5 Western blot法检测对照组和干扰组心肌细胞中PKN1和cyclin D1蛋白表达

取对照组和干扰组心肌细胞,分别加入含蛋白酶抑制剂的放射免疫沉淀法裂解缓冲液,4 ℃下裂解 30 min,离心后收集的上清液即为总蛋白提取物。使用二喹啉甲酸法蛋白质定量分析试剂盒测定蛋白浓度,然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳结束后将凝胶转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜置于含有体积分数5%牛血清白蛋白的Tris盐酸缓冲盐溶液中,室温封闭2 h,滴加PKN1一抗(滴度为11 000)、cyclin D1一抗(滴度为11 000)、β-tubulin一抗(滴度为15 000),4 ℃孵育过夜。用含吐温20的Tris盐酸缓冲盐溶液洗涤3次,滴加山羊抗兔二抗,室温下孵育1 h,加入电化学发光显色液显影,使用化学发光成像仪成像。应用Image J软件检测各条带灰度值,以β-tubulin为内参,以目的蛋白条带与内参蛋白灰度值比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 小鼠心肌细胞和心肌组织中Ki-67阳性表达率比较

对照组和干扰组心肌细胞中Ki-67阳性表达率分别为(15.44±1.87)%、(8.54±1.33)%,正常组和观察组小鼠心肌组织中Ki-67阳性表达率分别为(13.70±1.60)%、(5.14±1.00)%。干扰组心肌细胞中Ki-67阳性表达率均显著低于对照组,差异有统计学意义(t=11.201,P<0.01)。观察组小鼠心肌组织中Ki-67阳性表达率显著低于正常组,差异有统计学(t=11.851,P<0.01)。结果见图1和图2。

图1 对照组和干扰组心肌细胞中Ki-67表达情况(免疫荧光法,×200)

图2 正常组和观察组小鼠心肌组织中Ki-67表达情况(免疫荧光法,×200)

2.2 对照组与干扰组小鼠心肌细胞中PKN1 mRNA相对表达量比较

对照组和干扰组小鼠心肌细胞中PKN1 mRNA相对表达量分别为1.007±0.025、0.430±0.140。干扰组小鼠心肌细胞中PKN1 mRNA相对表达量显著低于对照组,差异有统计学意义(t=7.022,P<0.01)。

2.3 对照组与干扰组小鼠心肌细胞中PKN1和cyclin D1蛋白相对表达量比较

对照组和干扰组小鼠心肌细胞中PKN1蛋白相对表达量分别为0.983±0.165、0.317±0.113,对照组和干扰组小鼠心肌细胞中cyclin D1蛋白相对表达量分别为0.747±0.116、0.237±0.055。干扰组小鼠心肌细胞中PKN1和cyclin D1蛋白相对表达量均显著低于对照组,差异有统计学意义(t=5.762、6.884,P<0.01)。结果见图3。

图3 对照组和干扰组小鼠心肌细胞中PKN1和cyclin D1蛋白表达(Western blot)

3 讨论

心肌梗死及心肌梗死导致的心力衰竭严重威胁着人类健康,是心血管疾病患者的主要死因之一[8]。心肌梗死会导致心肌细胞不可逆的坏死,因此,诱导心肌细胞增殖是改善心肌梗死后心功能的一种有效方法[9]。寻找内源性靶点进而促进心肌细胞增殖被视为一种心肌梗死及心力衰竭后促进心肌组织修复的途径[10]。PKN1是体内重要的信号调控因子,在心血管疾病如动脉损伤后再狭窄和心肌缺血中发挥着重要的作用[11]。FRANCOIS等[7]研究表明,过表达PKN1可以促进多种细胞如血管平滑肌细胞和上皮干细胞增殖及迁移。但PKN1能否调控心肌细胞增殖目前尚不清楚。Cyclin D1是调控细胞周期G1期的关键蛋白,对整个细胞周期调控至关重要[12]。调控细胞周期可以促进肿瘤细胞、干细胞及心肌细胞增殖,对于调控疾病发展非常重要[13-15]。然而,PKN1能否通过调节cyclin D1介导心肌细胞增殖目前尚不清楚。

本研究通过小鼠体内外实验显示,干扰组心肌细胞中Ki-67阳性表达率均显著低于对照组,观察组小鼠心肌组织中Ki-67阳性表达率显著低于正常组;此外,本研究结果表明,干扰组小鼠心肌细胞中PKN1 蛋白和mRNA相对表达量均显著低于对照组。这表明,通过降低小鼠心肌细胞中PKN1表达,可抑制小鼠心肌细胞的增殖能力。

为了探究PKN1调控心肌细胞增殖的机制,本研究通过 Western blot检测cyclin D1蛋白表达,结果显示,干扰组小鼠心肌细胞中cyclin D1蛋白相对表达量显著低于对照组;这表明,在小鼠心肌细胞中PKN1表达降低可抑制cyclin D1蛋白表达,从而抑制心肌细胞增殖,其机制可能与调控细胞周期有关。

4 结论

在小鼠心肌细胞中PKN1表达降低可抑制cyclin D1蛋白表达,从而抑制心肌细胞增殖。本研究为调控心肌细胞增殖提供了新的靶点,为心肌梗死后心功能恢复奠定基础。未来将通过设置PKN1高表达组进一步验证PKN1对心肌细胞增殖的调控作用及机制。