黄花蒿精油抑菌、抗氧化及毒理学特性研究

陈文丹，白玉莹，郭成虎，柴玉宏，王丰俊，黄丛林,*，刘 华,*

（1.北京市农林科学院，北京 100089；2.中央储备粮宁陵直属库有限公司，河南商丘 476111；3.北京林业大学生物科学与技术学院，北京 100083）

植物精油为植物特有的一类芳香物质，属于次生代谢物质，可随水蒸气蒸发，是具有一定挥发性油状液体的总称[1]。大多数精油具有广泛的抗菌活性，对许多真菌和细菌都具有一定的抑菌和杀菌效果[2-3]。黄花蒿又名青蒿，为菊科蒿属一年生草本植物，蒿属是菊科植物中分布最广、最大的属之一，共有350 多种，中国约有185 种[4]。黄花蒿被广泛用于香料和药用植物，其化学成分可分为挥发性成分与非挥发性成分，挥发性成分主要为精油。黄花蒿精油是从黄花蒿中提取出的挥发油，是一种淡黄色油状液体，主要由单萜和倍半萜组成，富含樟脑、β-芹子烯、α-蒎烯和蒿酮等萜烯类化合物，具有香气，且含有丰富的生物活性成分，具有抗菌、驱蚊、杀虫、抗氧化等活性，因而被广泛用于民间医药[5]。Wu 等[6]通过测定黄花蒿精油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果，发现其抑菌圈直径在10.7～17.0 mm，且对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效果均较为显著。

常见的植物精油提取方法有压榨法[7]、有机溶剂萃取法[8]、亚临界流体萃取法[9]、水蒸气蒸馏法[10]等。与其它提取方法相比，本研究所采用的水蒸气蒸馏法具有成本低、安全无污染等优点，可用于肉桂[11]、狮头柑[12]等植物精油的提取。李玲玲[13]、Hong 等[14]均采用水蒸气蒸馏法提取黄花蒿精油。

目前，对于黄花蒿的研究主要是从黄花蒿里提取青蒿素——一种高效抗疟疾的化合物[15-17]，而关于黄花蒿精油化学成分分析及其生理活性研究的报道鲜为少见。因此，本研究可为精油取代一些合成防腐剂提供理论依据，同时为黄花蒿精油的开发利用提供实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

722/722S 分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；FE28-Standard pH 计 上海托利多仪器有限公司；FA2004 型电子天平 上海上平仪器有限公司；8890-7000 D 型气相色谱-质谱联用仪 Agilent安捷伦（美国）。

1.2 实验方法

1.2.1 黄花蒿精油的提取 采用水蒸气蒸馏法[18]提取黄花蒿精油，称取黄花蒿的叶和茎6 kg，粉碎，以料液比1:2（g/mL）加入去离子水，将其放入精油提取装备中，加热至沸腾后开始计时，提取时间为3 h，提取得到的黄花蒿精油冷却至室温，放置在深色玻璃瓶中，并在4 ℃保存。以一定质量黄花蒿所提取的精油质量来计算黄花蒿精油的产率，产率按式（1）进行计算。

式中：m 表示黄花蒿精油质量，g；M 表示黄花蒿的质量，g。

1.2.2 GC-MS 分析 GC 条件：色谱柱为DB-5MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气：He（99.999%），恒流流速1.2 mL/min，进样口温度250 ℃，不分流进样，溶剂延迟3.5 min。升温程序：初始柱温为40 ℃，持续3.5 min，以10 ℃/min 升温至100 ℃，再以7 ℃/min 升温至180 ℃，最后以25 ℃/min 升温至280 ℃，保持5 min。

MS 条件：电子轰击（EI）离子源，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，质谱接口温度280 ℃，电子能量70 eV，扫描方式为选择离子检测模式（SIM）。

1.2.3 抗氧化性测定

1.2.3.1 DPPH 自由基清除率测定 黄花蒿精油的DPPH 自由基清除率参考Mollaei 等[19]的方法进行测定，并稍加修改。将2 mL 的DPPH 溶液（0.1 mmol/L）与2 mL 不同浓度梯度（2、4、6、8、10 mg/mL）的黄花蒿精油混合，摇匀后将混合溶液置于黑暗处反应30 min，反应完成后于517 nm 波长下测定其吸光值。按同样方法用维生素C 代替黄花蒿精油作阳性对照，所有实验均重复三次。DPPH 自由基的清除能力用公式（2）进行测定。

水，冒着热气，只有大半桶。田志芳立即抖散行李，取出搪瓷缸，舀半缸，猛喝一口，差点全喷出来。水，又苦又涩，田志芳看看铁桶，看看茶缸，眼泪一下涌出来，这一路她没哭，她提醒自己是班长，要带头做表率，不能哭，不能不坚强，可这水，这又苦又涩的水，像她眼泪一样的水，让她的眼泪汩汩地流出来。田志芳这会儿强烈思念家乡。

式中：A0表示对照（不含黄花蒿样品）的吸光度；A1表示样品的吸光度。

1.2.3.2 羟基自由基清除率测定 黄花蒿精油对羟基自由基清除率的测定采用水杨酸法进行测定[20]。将0.5 mL 不同浓度梯度的黄花蒿精油溶液（2、4、6、8、10 mg/mL），0.5 mL 浓度为2 mmol/L 的水杨酸-无 水 乙 醇 溶 液，0.5 mL 浓 度 为1 mmol/L 的Fe2SO4溶液，1 mL 浓度为2 mmol/L 的H2O2溶液依次加入试管中，充分振荡混匀后静置30 min，在510 nm 波长下测定其吸光值。按同样方法用维生素C 代替黄花蒿精油作阳性对照，所有实验均重复三次。用公式（3）计算清除羟基自由基的清除能力。

式中：A0表示对照（不含黄花蒿样品）的吸光度；A1表示样品的吸光度；A2表示不加硫酸亚铁溶液的吸光度。

1.2.4 抑菌活性 采用琼脂扩散法评估黄花蒿精油抑菌活性。在超净台中，将200 μL 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌悬液（约为108CFU/mL）均匀地涂抹在LB 琼脂板上。用灭菌后的镊子夹滤纸片（直径6 mm）放置于上述培养皿内，将6 μL 的黄花蒿精油添加到6 mm 的滤纸片上。在37 ℃培养箱中孵育24 h。使用游标卡尺测量抑菌圈的直径并求平均值。所有实验均重复三次。

1.2.5 半数致死剂量（LD50）的确定 小鼠饲养在室温（22±2）℃、相对湿度50%～55%的动物房内。预实验选用小鼠18 只，动物福利伦理审查批文号为YXSW2112165978，雌雄各占1/2，试验前禁食不禁饮水16 h，将黄花蒿精油用羧甲基纤维素钠稀释。每组6 只小鼠，三组分别按照100、1000、10000 mg/kg体重剂量对小鼠进行一次性灌胃，观察7 d，记录小鼠中毒及死亡情况，估计LD50的可能范围及确定正式试验的剂量组。

在预试验的基础上选用小鼠60 只，随机分为6 组，每组10 只，雌雄各半。小鼠先适应性喂养3 d，灌胃前禁食不禁水16 h。六个组分别按5000.0、6597.7、8705.7、11487.1、15157.3、20000.0 mg/kg进行一次性灌胃，以生理盐水灌胃作对照，连续观察14 d。观察期内记录动物死亡数、体重变化和中毒表现等，最后通过剂量-反应曲线的对数回归分析确定LD50。死亡率按公式（4）进行计算。

式中：W 表示死亡率，%；n 表示每组中死亡的小鼠数量，只；N 表示每组中小鼠的总数量，只。

1.3 数据处理

所有试验均做三次重复操作，并将试验结果以平均值±标准差表示。所有试验数据的处理与分析均使用SPSS 23.0 软件进行，显著性分析使用Duncan和ANOVA 法，P＜0.05 时表示数据间存在显著性差异，使用Origin 8.0 软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 黄花蒿精油的成分分析

本实验采用水蒸气蒸馏法，提取得到的黄花蒿精油产率为1.04‰。通过GC-MS 对黄花蒿精油的化学成分进行分析，共检测到332 种化合物，其中22 个组分占总成分的71.09%，主要为萜类、芳烃、酚、醇、醛、酯，各化学组分见表1。测得黄花蒿精油中主要成分为萜类，其中蒿酮占19.34%，具有抗炎、抗氧化的作用[21]；（+）-α-蒎烯占6.10%，具有抑菌、消炎的作用[22]。产地为马德拉群岛的黄花蒿精油经过GC-MS 分析，主要成分为萜类化合物与本研究结果相似[21]；而产地为法国马赛黄花蒿精油的主要成分为樟脑（44%），这可能是由于其产地、采收季节、提取方式的不同而造成的差异[23]。

表1 黄花蒿精油的成分分析Table 1 Composition analysis of Artemisia annua essential oil

2.2 黄花蒿精油抗氧化性活性的测定

2.2.1 DPPH 自由基的清除能力 DPPH 自由基是一种稳定的有机自由基，DPPH 中孤电子吸光度降低的程度与样品的抗氧化程度呈定量关系，因此可用分光光度计进行分析[24]。如图1 所示，黄花蒿精油浓度在2～10 mg/mL 范围内，DPPH 自由基清除率随精油浓度的增加而增大，表现出良好的量效关系，当黄花蒿精油浓度为10 mg/mL 时，DPPH 自由基的清除率最大，为40.03%，该结果与Munda 等[25]对产地为印度的黄花蒿叶片提取精油的研究得出DPPH 自由基清除率随精油浓度的增加而增大这一结果相似。周江菊等[26]研究发现一些萜类化合物也与抗氧化性有密切关系，如α-蒎烯、石竹烯、柠檬烯等萜类物质均有较强的自由基清除能力；吴均等[27]发现甜橙精油中D-柠檬烯（42.79%）和α-蒎烯（4.54%）的相对含量较高，且甜橙精油具有较强的抗氧化活性。本实验中黄花蒿精油的主要成分为萜类化合物，α-蒎烯（6.1%）为萜类化合物中含量较高的一种成分，因而可得出α-蒎烯可能与抗氧化活性有关。同时，从表2可知，当黄花蒿精油对自由基的清除率达到50%时，其IC50值为6.76 mg/mL。

图1 黄花蒿精油的DPPH 自由基清除率Fig.1 Scavenging rate of DPPH free radicals by Artemisia annua essential oil

表2 DPPH 自由基清除率与黄花蒿精油加入量的线性关系及IC50 值Table 2 Linear relationship between the DPPH free radical scavenging rate and the amount of Artemisia annua essential oil and IC50 value

2.2.2 羟基自由基的清除能力 羟基自由基是一种易于发生化学反应的自由基，其清除率的大小是用于评价抗氧化性的一项重要指标[28]。如图2 所示，黄花蒿精油清除羟基自由基能力随着浓度的升高而增强，存在一定的剂量依赖关系。当黄花蒿精油浓度为10 mg/mL 时，羟基自由基的清除率可达92.97%，与阳性对照相比，表明黄花蒿精油的羟基自由基清除能力较强。这一结果与王莉等[29]研究花椒籽精油抗氧化能力得出其羟基自由基与抗氧化能力呈浓度依赖性这一结果相似，当花椒精油浓度为10%时，其清除率可达79.68%。同时，从表3 可知，黄花蒿精油对羟基自由基的IC50为1.9 mg/mL。

图2 羟基自由基的清除率Fig.2 Hydroxyl radical scavenging rate

表3 羟基自由基清除率与黄花蒿精油加入量的线性关系及IC50 值Table 3 Linear relationship between hydroxyl radical scavenging rate and the amount of Artemisia annua essential oil and IC50 value

2.3 抑菌活性

黄花蒿精油的抑菌效果如图3 所示。结果表明，黄花蒿精油对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为12.67±0.29 mm，而对革兰氏阴性菌大肠杆菌的抑菌圈直径为9.27±0.25 mm，因此可知黄花蒿精油对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于大肠杆菌。这一结果与精油对革兰氏阳性菌的活性略高于革兰氏阴性菌这一结论相一致，这可能是由于革兰氏阳性菌的细胞膜与精油的疏水组分可以相互作用；而革兰氏阴性菌因为含有亲水性的细胞壁，所以对精油有一定抵抗力[30]。同时，精油活性的发挥还受细菌形状的影响，本研究结果与杆状细胞比球菌状细胞更容易对抑菌活性有影响[31]这一结论相一致。

图3 黄花蒿精油对金黄色葡萄球菌（A）和大肠杆菌（B）的抑菌圈Fig.3 Inhibition zone of Artemisia annua essential oil on Staphylococcus aureus (A) and Escherichia coli (B)

除此之外，精油的抗菌活性还可能与其成分相关，主要与单萜、三萜、倍半萜烃类及含氧衍生物相关。研究表明植物精油中的主要成分有萜类、芳香族等化合物，其中芳香族、酚类和萜类起到较强抗菌效果[32]。根据黄花蒿精油的GC-MS 结果显示，其富含丰富的萜类化合物29 种（蒿酮、（+）-α-蒎烯等），芳烃类5 种（六-2,4-二炔-1-基苯、1-甲基-3-(1-甲基乙基)-苯等），这也为黄花蒿精油的抑菌活性提供数据支撑。

2.4 黄花蒿精油毒理学特性试验

本研究通过观察小鼠精油灌胃后的中毒行为及死亡率来评估其急性毒性，进而评估黄花蒿精油的安全性。预试验中精油灌注量达到1000 mg/kg 时，未见小鼠的中毒反应，而当精油灌注量达到10000 mg/kg时，50%的小鼠死亡。在预试验基础上进行5000～20000 mg/kg 共6 个剂量组一次性灌胃，小鼠的致死率和中毒症状结果见表4。小鼠腹腔注射黄花蒿精油时，5000 mg/kg 剂量对小鼠无不良影响。但随着注入精油剂量的增加，小鼠的中毒症状更加明显，死亡率也增加。当小鼠注射高剂量溶液10 min 后开始出现异常行为，如呼吸困难和活动迟缓。

表4 黄花蒿精油对小鼠急性毒性试验结果Table 4 Results of acute toxicity test of Artemisia annua essential oil in mice

评估精油的LD50，判断其安全性对于食品的生产是十分重要的一个环节[33]。通过剂量-反应曲线的线性回归，得出半数致死量LD50浓度为7491 mg/kg。根据急性毒性剂量分级表，提取的黄花蒿精油无毒。

小鼠的体重变化是毒理学考察的一个重要指标，加入精油后小鼠的体重突然增大或减小是中毒作用的表现之一[34]。将6 个剂量组的精油溶液对小鼠进行一次性灌胃，分别在0、3、7、10、14 d 测量小鼠体重。小鼠被不同剂量精油灌胃后体重变化结果见表5，当小鼠被灌注低剂量精油时，其体重随着灌注时间的增长而增加，而当小鼠被灌注高剂量精油时，其体重随着灌注时间的增长无较大变化；小鼠被不同剂量的精油灌胃后，在0、3、7、10 d 体重并无较大变化，在14 d 时，小鼠体重因灌胃的剂量不同发生了较大变化，这可能是因为高剂量精油在小鼠体内存留时间较长，导致小鼠发生部分死亡甚至全部死亡，从而使得小鼠体重不再变化。

表5 黄花蒿精油对小鼠体重变化的结果Table 5 Results of Artemisia annua essential oil on body weight changes in mice

3 结论

采用水蒸气蒸馏法提取黄花蒿精油，产率为1.04‰。黄花蒿精油经GC-MS 分析鉴定出332 种成分，其中22 个组分含量较高，占总成分的71.09%，包括萜类、酯、醇、醛等化合物，其中主要成分为蒿酮（19.34%），（+）-α-蒎烯（6.10%）。通过对DPPH 自由基清除率、羟自由基清除率和总抗氧化性能力的测试，发现黄花蒿精油的抗氧化能力与黄花蒿精油浓度存在一定的剂量效应对应关系。随着黄花蒿精油浓度的提高，其抗氧化能力逐渐增强。当黄花蒿精油浓度为10 mg/mL 时，DPPH 自由基清除率可达到40.03%；羟基自由基清除率可达92.97%；黄花蒿精油的总抗氧化能力也随着浓度的增加而增加。黄花蒿精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑菌效果，且对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于大肠杆菌。测定黄花蒿精油的LD50为7491 mg/kg，根据急性毒性剂量分级表，证明提取的黄花蒿精油是无毒的。

本研究对蒿属植物—黄花蒿进行了精油提取、抗氧化、抑菌、毒理学性质的分析，说明黄花蒿精油在天然抗氧化剂和抑菌剂方面极具开发价值，可为蒿属植物的开发提供一定的理论依据及技术支撑，将有助于天然生物活性化合物在食品添加剂中的应用。但本研究未对其抑菌机理进行深入研究，因此未来可在此基础上对黄花蒿精油进行进一步的研究与开发利用。

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