CXCL14 在慢性危重症模型小鼠心功能损伤中的作用

周诗涵 曾龙欢 徐汉乔 赵 东 郑永科

近年来生命支持水平不断提高，越来越多的危重患者得以度过疾病急性期，但仍有部分患者难以完全恢复，病情进展至慢性状态，需要长期重症监护治疗，称为慢性危重症（chronic critical illness，CCI），其特点是存在持续性炎性反应、免疫抑制和分解代谢状态[1-2]。CCI 不仅死亡率高、预后不佳，还占用大量医疗资源，造成了严重的家庭和社会负担[3-6]。心功能损伤是导致CCI 及其不良预后的重要原因[7]。临床研究表明，CCI 中心力衰竭的发生率约为62.7%，而一年期死亡率可达18.1%[8-9]。因此，针对CCI 心功能损伤开展相关研究，对改善CCI 患者预后十分重要。CXC 趋化因子配体14（CXCL14）为CXC 趋化因子家族中ELR 亚家族中的一员，能反映巨噬细胞浸润，调节氧化应激与炎症反应，在骨骼肌损伤和心肌梗死中都有重要作用[10-12]。但是，CXCL14 在CCI 心功能损伤中的作用尚不明确。因此，本研究在既往研究的基础上，通过构建CCI 动物模型，探讨CXCL14 在CCI 心功能损伤中的作用。

1 实验材料

1.1 实验动物 选用8～10 周龄雄性野生型C57BL/6 小鼠共24 只，体质量450～600 g，所有动物购自浙江中医药大学动物实验研究中心，动物生产许可证号为SCXK（沪）2022-0004。各组小鼠均于温度（25±2）℃、湿度40%～70%的SPF 房内适应性饲养1 周后进行实验，饲养期间允许小鼠自由摄食饮水，通过腹腔注射过量戊巴比妥钠麻醉安乐死。本研究由浙江大学实验动物福利伦理审查委员会批准（编号：17475），并按照《实验动物护理和使用指南》进行。

1.2 试 剂 重组CXCL14（批号ab50043）、多克隆抗CXCL14 抗体（批号ab217307）、人CXCL14 酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（批号ab213771）购自abcam 公司；大鼠 脑钠素（BNP）ELISA 试剂 盒（Elabscience 公司，批号E-EL-R0126c）；苏木素伊红染色（HE）试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号20220324）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（中国碧云天公司，批号P0012）；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）（杭州贤至生物有限公司，AB-P-R 001，1∶1000）；α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）（美国Affinity Biosciences公司，AF1032，1∶1000）；Ⅲ型胶原蛋白（CollagenⅢ）（美国Affinity Biosciences 公司，AF5457，1∶1000）。

1.3 主要仪器 MyLab X5 VET 兽医超声波检查仪（意大利Esaote 公司）；M1324R 微量高速冷冻离心机（深圳瑞沃德生命科技有限公司）；HR40-Ⅱ-A2 型医用净化工作台（青岛海尔特种电器有限公司）；WES 全自动蛋白定量分析仪（美国Protein Simple 公司）；DFC 7000T 型倒置显微镜（德国Leica 公司）；Tissue-Tearor 手持式匀浆机（中国净信公司）。

2 实验方法

2.1 CCI 模型建立及分组 按随机数字表法将24只小鼠分成假手术组、CCI 组、CCI+CXCL14 组和CCI+Anti-CXCL14 组，每 组6 只。CCI 组、CCI+CXCL14 组和CCI+Anti-CXCL14 组小鼠予腹膜内注射4%戊巴比妥钠（1 mL/kg）麻醉，行盲肠结扎穿刺术，术后皮下注射生理盐水（10 mL/kg）进行液体复苏，一次性口服扑热息痛（100 mg/kg）。假手术组小鼠腹膜内注射4%戊巴比妥钠（1 mL/kg）麻醉，腹部切口暴露，但不结扎和穿刺，随后缝合腹腔。按分组情况，CCI 组小鼠予磷酸缓冲盐溶液（PBS）2 μL 心内注入；CCI+CXCL14 组小鼠予重组CXCL14 1 μg 心内注入；CCI+Anti-CXCL14 组小鼠予多克隆抗CXCL14抗体1 μg 心内注入。所有小鼠可以自由饮水和进食，观察10 d，若出现明显的慢性脓毒症表现：肌肉萎缩、毛发竖立、过度兴奋、结膜出血、肝微脓肿、脾大和腹水混浊（腹水和血培养物为大肠杆菌）等，提示造模成功。

2.2 超声心动图评估心功能 采用兽医超声波检查仪，S3116 探头，20 MHz 频率检测。麻醉后，用脱毛膏脱去成像目标区的毛发，涂抹耦合剂后将探头置于动物体表进行图像采集。测量各组小鼠左心室射血分数（LVEF）。

2.3 测定BNP 水平 经尾静脉采血1.5 mL，以转速3000 r/min，离心半径10 cm，离心15 min，取上清液，按试剂盒说明进行ELISA 检测，使用BNP 条带密度测量数据的标准化比率（fold change）计算BNP 水平的变化。

2.4 测定心肌组织CXCL14 含量 取心肌组织，用生理盐水洗净并充分吸干水分，以9∶1 的比例将生理盐水与心肌组织加入离心管中，用眼科小剪刀将心肌组织剪成小碎片，采用组织匀浆机制成10%心肌组织匀浆液，按ELISA 试剂盒说明检测心肌组织CXCL14 含量。

2.5 HE 染色观察心肌组织 取小鼠心肌组织，经甲醛固定、脱水、透明处理后，进行石蜡包埋处理。蜡块通过病理切片机切成5 μm 厚切片。切片入Mayer氏苏木素染液染色5 min，流水冲洗。切片入1%的盐酸乙醇分化5 s，流水冲洗返蓝。伊红染色1 min，根据染色情况，流水冲洗。切片脱水后，中性树胶封片，镜检。

2.6 蛋白质印迹（Western blot）检测 组织经RIPA裂解液裂解后，使用BCA 蛋白定量试剂盒完成蛋白浓度检测。等浓度的蛋白样本通过SDS-PAGE 分离后，转移至PVDF 膜。然后使用含5%脱脂奶粉的TBST 浸泡PVDF 膜，室温摇床封闭2 h。封闭液稀释相应的一抗（GAPDH，1∶1000；α-SMA，1∶1000；CollagenⅢ，1∶1000），并将PVDF 膜浸泡于一抗孵育液中，4 ℃孵育过夜。PVDF 膜经TBST 充分洗涤后，浸泡至封闭液稀释的HRP 标记二抗孵育液，37 ℃摇床孵育2 h。然后将ECL 试剂盒中的工作液滴加于PVDF 膜上，使用扫描仪完成胶片扫描，并使用BandScan 软件分析胶片灰度值。

2.7 统计学方法 应用Prism9.0 统计软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组小鼠心功能指标比较 与假手术组小鼠比较，CCI 组小鼠LVEF 显著降低，BNP 水平升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与CCI 组比较，CXCL14 重组蛋白处理可进一步降低CCI 模型小鼠LVEF（P＜0.05），并且升高BNP 水平（P＜0.01）；CXCL14 抗体处理可抑制CCI 模型小鼠LVEF 降低（P＜0.01），抑制BNP 水平升高（P＜0.01）。见表1。

表1 各组小鼠心功能指标比较（±s）

表1 各组小鼠心功能指标比较（±s）

注：CCI 为慢性危重症；CXCL14 为CXC 趋化因子配体14；Anti-CXCL14 为CXC 趋化因子配体14 抗体；LVEF 为左心室射血分数；BNP 为脑钠素；与假手术组比较，aP＜0.01；与CCI 组比较，bP＜0.05，cP＜0.01

组别假手术组CCI 组CCI+CXCL14 组CCI+Anti-CXCL14 组鼠数6666 LVEF（%）74.31±2.16 59.17±3.35a 50.97±3.52b 69.29±2.08c BNP（fold change）6.07±0.45 11.27±0.50a 14.73±0.74c 8.77±0.40c

3.2 各组小鼠心肌组织HE 染色 与假手术组比较，CCI 模型小鼠心肌细胞体积增大，心肌纤维排列散乱，且部分细胞出现细胞质空泡化。与CCI 组比较，CXCL14 重组蛋白可进一步增加CCI 模型小鼠心肌细胞体积增大以及细胞质空泡化，心肌纤维排列散乱加重，CXCL14 抗体注射处理则可抑制CCI 模型小鼠心肌细胞体积增大及细胞质空泡化，改善心肌纤维排列散乱的情况。见图1。

图1 各组小鼠心肌组织HE 染色（×200）

3.3 各组小鼠心肌组织CXCL14 表达水平比较 与假手术组小鼠比较，CCI 组小鼠心肌组织CXCL14 含量升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。与CCI 组比较，CXCL14 重组蛋白可进一步增加CXCL14 含量，差异有统计学意义（P＜0.01），CXCL14 抗体注射处理可降低心肌组织CXCL14 含量，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 各组小鼠心肌组织CXCL14 表达水平比较（ng/mg protein，±s）

表2 各组小鼠心肌组织CXCL14 表达水平比较（ng/mg protein，±s）

注：CCI 为慢性危重症；CXCL14 为CXC 趋化因子配体14；Anti-CXCL14 为CXC 趋化因子配体14 抗体；与假手术组比较，aP＜0.01；与CCI 组比较，bP＜0.01

组别假手术组CCI 组CCI+CXCL14 组CCI+Anti-CXCL14 组鼠数6666 CXCL14 0.40±0.03 0.55±0.02a 0.75±0.05b 0.54±0.05

3.4 各组小鼠心肌组织α-SMA、CollagenⅢ表达水平比较 与假手术组比较，CCI 组小鼠心肌组织α-SMA 和CollagenⅢ表达增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。与CCI 组比较，CXCL14 重组蛋白可进一步升高心肌纤维化相关蛋白α-SMA，差异有统计学意义（P＜0.05），CollagenⅢ表达水平略有升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）；CXCL14 抗体注射处理则可抑制CCI 模型小鼠心肌组织α-SMA 和CollagenⅢ表达，差异有统计学意义（P＜0.01）。见图2 和表3～4。

图2 各组小鼠心肌组织α-SMA、CollagenⅢ表达水平比较

表3 假手术组、CCI 组、CCI+CXCL14 组小鼠心肌组织α-SMA 和CollagenⅢ相对表达水平比较（±s）

表3 假手术组、CCI 组、CCI+CXCL14 组小鼠心肌组织α-SMA 和CollagenⅢ相对表达水平比较（±s）

注：CCI 为慢性危重症；CXCL14 为CXC 趋化因子配体14；α-SMA 为α-平滑肌肌动蛋白；CollagenⅢ为Ⅲ型胶原蛋白；与假手术组比较，aP＜0.01；与CCI 组比较，bP＜0.05

组别假手术组CCI 组CCI+CXCL14 组鼠数666 α-SMA 0.31±0.05 0.66±0.02a 0.79±0.05b CollagenⅢ0.40±0.04 0.64±0.04a 0.75±0.06

表4 假手术组、CCI 组、CCI+anti-CXCL14 组小鼠心肌组织α-SMA 和CollagenⅢ相对表达水平比较（±s）

表4 假手术组、CCI 组、CCI+anti-CXCL14 组小鼠心肌组织α-SMA 和CollagenⅢ相对表达水平比较（±s）

注：CCI 为慢性危重症；Anti-CXCL14 为CXC 趋化因子配体14 抗体；α-SMA 为α-平滑肌肌动蛋白；CollagenⅢ为Ⅲ型胶原蛋白；与假手术组比较，aP＜0.01；与CCI 组比较，bP＜0.01

组别假手术组CCI 组CCI+Anti-CXCL14 组鼠数666 α-SMA 0.40±0.02 0.77±0.04a 0.61±0.03b CollagenⅢ0.35±0.03 0.80±0.05a 0.57±0.04b

4 讨 论

导致CCI 的因素很多，除了呼吸、营养等因素外，心功能损伤也不能忽视。有研究发现，即使经过抗生素治疗，脓毒症带来的心肌损伤仍然会导致心肌重构，造成心功能损伤，是CCI 发生的重要原因[13]。本研究通过动物实验发现，与假手术组比较，CCI 动物模型组BNP 升高、LVEF 降低，说明CCI 模型小鼠存在心功能损伤，与既往临床研究结果一致。可能的机制是CCI 大多伴有脓毒血症，感染引起的全身炎症反应导致心肌细胞对肾上腺素反应迟钝，收缩蛋白对钙离子转运水平下降，使得心脏舒张和收缩功能降低，进而损伤心功能[14]。因此，针对心功能损伤开展相关研究有利于改善CCI 的预后。

作为趋化因子家族中的一员，CXCL14 主要表达于一些免疫细胞，可趋化树突状细胞及自然杀伤细胞等的募集，参与介导炎症免疫反应[15-16]。已有研究表明，CXCL14 与心肌梗死、感染性疾病有关[12，17]，但是CXCL14 在CCI 心功能损伤中的作用鲜有报道。本研究发现，CCI 模型小鼠心肌组织CXCL14 含量显著高于假手术组，与BNP 和LVEF 的变化趋势一致，并且伴有心肌细胞体积增大、排列紊乱以及细胞质空泡化。此外，心肌纤维化相关的心肌α-SMA 和CollagenⅢ蛋白表达亦显著增加。提示CXCL14 可能通过促进心肌纤维化造成心功能损伤。CXCL14 作为趋化因子，可以触发炎症细胞发生迁移而产生炎症反应[18]。Schories 等[19]研究发现，心功能损伤患者CXCL14 表达水平高于正常心功能患者。另一项动物研究也表明，CXCL14 表达下调能够恢复受损的心肌细胞增殖，最终改善心脏功能，在一定程度上均证实了我们的结论[20]。

综上所述，本研究发现CCI 模型小鼠中存在心功能损伤，可能与CXCL14 上调诱导心肌纤维化相关，提示CXCL14 可能在CCI 心功能损伤中发挥重要作用。然而，CXCL14 在心功能损伤中的具体调控机制以及在CCI 中的临床价值尚不明确，有待进一步研究。