基于PI3K/AKT 通路探讨何氏补肾厚膜方改善大鼠薄型子宫内膜的作用机制

徐新亚 陈碧霞 吴晓婷

薄型子宫内膜（thin endometrium，TE）是近年来生殖医学领域研究的热点，是影响辅助生殖技术（ART）临床妊娠结局的关键因素[1]。2019 年加拿大生育和男科学会（CFAS）指南规定，人绒毛膜促性腺激素给药当天子宫内膜厚度＜8 mm，冷冻移植周期子宫内膜厚度＜7 mm 代表TE[2]。TE 的发病与炎症、医源性操作等有关，然而相关机制尚不清楚。研究表明，除了子宫内膜厚度的差异外，TE 患者还患有血管发育不良，导致子宫动脉血流阻力显著增加，从而抑制子宫内膜容受性[3]。何氏补肾厚膜方（Heshi Bushen Houmo Prescription，HBHP）是何氏妇科多年经验的总结，临床应用可以改善缺血后子宫内膜血流、增加内膜厚度。然而，目前关于HBHP 的作用机制缺乏相应的实验数据支持。磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信号通路激活是血管生成的调节中心[4]。研究证实，PI3K/AKT 信号通路抑制血管生成障碍导致子宫内膜容受性降低与TE 不孕症的发生有关[5]。因此，本研究基于PI3K/AKT 信号传导通路探究HBHP治疗TE 的作用机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动 物 48 只SPF 级雌性SD 大鼠（6～8 周，180～220 g）购自上海市计划生育科学研究所实验动物经营部[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2018-0006]。动物饲养在浙江中医药大学动物实验研究中心[实验动物使用许可证号：SYXK（浙）2021-0012]。本实验遵循浙江中医药大学实验动物的相关管理和规定。

1.2 药物与试剂 HBHP 方药组成：紫河车3 g，鹿角片、仙灵脾各10 g，菟丝子20 g，覆盆子15 g，枸杞子12 g，熟地10 g，当归15 g，川芎、炒白芍、赤芍、香附各10 g，黄芪15 g，由本院中药房提供（杭州华东中药饮片有限公司，批号20200628），用蒸馏水浸泡药物0.5 h，煮沸0.5 h 取滤液，煮两次合并滤液，用滤液冲泡紫河车粉，搅拌使充分溶解，再次过滤，取滤液灭菌后放入4 ℃冰箱冷藏备用。阿司匹林肠溶片（25 mg/片，辰欣药业股份有限公司，批号B20013021）。苏木精试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司，货号7211），伊红试剂盒（美国赛默飞世尔科技公司，货号7111）；磷酸化AKT（p-AKT）抗体试剂盒（美国Immunoway 公司，批号YT0185）、AKT 抗体试剂盒（美国Immunoway公司，批号YP0006）和PIK3 抗体试剂盒（美国Immu-noway 公司，批号YM0127）；超敏酶标山羊抗小鼠IgG 聚合物（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号2251D0509）；DAB（北京中杉金桥生物技术有限公司，批号232010317）；柱式法通用型RNA 提取试剂盒（日本Takara 公司，批号AK20985A）；预混型定量用反转录试剂盒（日本Takara 公司，批号AK22355A）；TB Green Premix Ex TaqTM荧光染料（日本 Takara 公司， 批号AK3112BA）。引物由上海生工合成。

1.3 主要仪器 显微镜（尼康，型号ECLIPSE 80i）；扫描仪（日本滨松，NanoZoomer 2.0RS）；JJ2000 型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；AR1140 高精密电子分析天平（美国奥豪斯电子分析天平）。

1.4 动物分组与造模、给药 48 只SD 雌性大鼠饲养在温度20～25 ℃、湿度45%～55%，12 h 循环照明的环境中，自由摄食饮水。适应1 周后按体质量随机分为对照组、模型组、阳性组和HBHP 组，每组12只。除对照组外，其他组参照文献方法在发情期对大鼠右侧子宫建立TE 模型[6]。运用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，腹部常规消毒后，在下腹部距腹中线右侧5 mm 处做一个垂直切口（1～2 cm）。暴露腹腔后，将右侧子宫轻轻拉出。用两个止血夹封闭子宫、卵巢和近端阴道之间的连接处。用1 mL 注射器将约0.3 mL 95%乙醇从卵巢远端缓慢注入子宫腔。5 min 后，移除子宫内乙醇，并移除夹钳。然后，用无菌盐水冲洗子宫腔2～3 次，并逐层关闭腹腔。术后给大鼠保温，苏醒后放回动物室。对照组大鼠采用相同的手术方式，只暴露子宫但未对子宫进行任何处理。

按照60 kg 成人与大鼠等效剂量比率为1∶6，计算出大鼠灌胃剂量。HBHP 组予HBHP 10 g/（kg·d），按1 mL/100 g 灌胃。阳性组接受小剂量阿司匹林肠溶片0.5 mg/（kg·d），按1 mL/100 g 灌胃；对照组及模型组每日灌服生理盐水1 mL/100 g。各组大鼠连续灌胃15 d 后，通过腹腔注射过量戊巴比妥钠麻醉安乐死，称大鼠体质量，取出子宫。

1.5 子宫湿重测量 用高精密电子天平秤大鼠子宫的质量，即子宫湿重。子宫脏器指数=子宫湿重/大鼠体质量×100%。

1.6 苏木精-伊红染色 石蜡包埋切片（3 μm）用二甲苯（20 min，2 次）、100%乙醇（5 min，2 次）和95%乙醇（5 min，2 次）进行脱蜡。HE 染色后，切片通过逐渐增加的乙醇梯度脱水，并用二甲苯透明。最后，用中性脂固定载玻片，在显微镜下观察腺体。使用NDP图像处理软件（2.7.52 版本）计算每单位面积的子宫内膜腺体数量。从每个切片中随机选择5 个视野用于计数子宫内膜腺体的数量。对每个切片进行3 次计数以获得平均值。此外，使用NDP 图像处理软件（2.7.52 版本）测量子宫内膜厚度。随机选择一个子宫样本的3 个切片进行观察。在每个切片的3、6、9 和12 点钟位置测量子宫内膜厚度，计算4 次测量的平均值作为一个切片的平均子宫内膜厚度。然后将3个切片的平均子宫内膜厚度作为特定组中一个样品的最终子宫内膜厚度。

1.7 免疫组织化学染色 内源过氧化物酶的活性用甲醇中的3%过氧化氢（H2O2）淬灭15 min。在预热的0.05%柠檬酸钠缓冲液中进行15 min 的抗原修复，然后用10%正常山羊血清封闭。载玻片在初级抗体[小鼠抗大鼠PIK3 单克隆抗体（1∶200 稀释）、小鼠抗大鼠AKT 单克隆抗体（1∶500 稀释）、小鼠抗大鼠p-AKT 单克隆抗体（1∶500 稀释）]中孵育过夜。将切片与辣根过氧化物酶（HRP）标记的第二抗体[超敏酶标山羊抗小鼠IgG 聚合物（1∶5000 稀释）]在室温孵育2 h。最后，切片用苏木精和DAB（3，3′-二氨基联苯胺）并用中性脂覆盖，在显微镜下观察载玻片。使用Image Pro Plus 6.0 软件计算不同组中p-AKT、AKT和PIK3 的表达。

1.8 逆转录-定量实时聚合酶链反应（reverse transcription -quantitative real -time polymerase chain reaction，RT-qPCR） 使用柱式法通用型RNA 提取试剂盒从各组大鼠子宫组织中提取总RNA。使用逆转录酶试剂盒将RNA 转录成cDNA。然后采用快速TB Green Premix Ex TaqTM和CFX384 多重实时荧光定量PCR 仪进行RT-qPCR 分析。PCR 反应条件设定为：在95 ℃循环30 s 后，进行38 个PCR 循环，每个循环包括变性步骤（95 ℃，5 s）和退火步骤（65 ℃，30 s）。相对mRNA 表达标准化为β-actin，用2-ΔΔCT法计算。引物序列：AKT：5′-TATATCTTCAAGCCGTCCTTG-3′（正向）和5′-TTGTTCTATCTTTTTGGTCTGC-3′（反向）；PI3K：5′-TGAGCATGAACTTCTGAAAAACG-3′（正向）和5′-CTCTTTGATCTGGTTCATGAGGT-3′（反向）；β-actin：5′-TATCGGCAATGAGCGGTTCC-3′（正向）和5′-AGCACTGTTGGCATAGAGG-3′（反向）。

1.9 统计学方法 应用SPSS 22.0 软件处理数据。符合正态分布的数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t 检验，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般观察 实验过程中，模型组、阳性组、HBHP 组各有1 只大鼠死亡，其余大鼠处于良好的生活状态，各组间没有表现出明显的差异。用药后未出现明显的药物不良反应或其他不适。

2.2 各组大鼠子宫组织学分析 大鼠子宫的组织学分析显示，对照组大鼠子宫腔形态完整，间质中腺体和血管分布正常。模型组大鼠宫腔较大，子宫壁整层变薄呈波状，结构不完整，腺体少，毛细血管稀疏。HBHP 组和阳性组显示子宫内膜厚度略厚，主要是完整的腺上皮细胞和管腔上皮细胞，连续的子宫内膜，腺体数量增加，毛细血管数量增多，排列整齐。与对照组比较，模型组的子宫湿重、子宫脏器指数、子宫内膜厚度和腺体数量显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，HBHP 组和阳性组子宫湿重、子宫脏器指数、子宫内膜厚度和腺体数量均明显增加（P＜0.05），HBHP 组较阳性组增加更明显（P＜0.05）。见图1 和表1。

表1 各组大鼠子宫湿重、子宫脏器指数、子宫内膜厚度和腺体数量比较（±s）

表1 各组大鼠子宫湿重、子宫脏器指数、子宫内膜厚度和腺体数量比较（±s）

注：HBHP 为何氏补肾厚膜方；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05；与阳性组比较，cP＜0.05

组别对照组模型组HBHP 组阳性组F 值P 值鼠数12 11 11 11子宫湿重（g）0.80±0.06 0.42±0.05a 0.75±0.06bc 0.68±0.08b 7.123＜0.001子宫脏器指数（%）0.30±0.03 0.16±0.02a 0.26±0.02bc 0.24±0.03b 5.831＜0.001子宫内膜厚度（μm）526.08±23.21 357.34±14.35a 476.74±21.42bc 438.18±22.39b 4.772＜0.001腺体数量19.08±1.31 8.09±1.57a 16.09±1.34bc 13.91±1.45b 8.754＜0.001

2.3 各组大鼠子宫内膜组织PI3K、AKT 及p-AKT蛋白表达比较 免疫组化分析结果显示，与对照组比较，模型组子宫内膜组织PI3K、AKT 及p-AKT 蛋白表达显著下调（P＜0.05）。与模型组比较，HBHP 组和阳性组子宫内膜组织PI3K、AKT 及p-AKT 蛋白表达显著上调（P＜0.05），阳性组与HBHP 组无显著差异（P＞0.05）。见表2。

表2 各组大鼠子宫内膜PI3K、AKT 及p-AKT 蛋白表达比较（±s）

表2 各组大鼠子宫内膜PI3K、AKT 及p-AKT 蛋白表达比较（±s）

注：HBHP 为何氏补肾厚膜方；AKT 为蛋白激酶B；p-AKT 为磷酸化AKT；PI3K 为磷脂酰肌醇激酶；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别对照组模型组HBHP 组阳性组F 值P 值鼠数12 11 11 11 AKT 蛋白0.71±0.11 0.21±0.01a 0.57±0.03b 0.43±0.05b 5.232 0.002 p-AKT 蛋白0.88±0.06 0.37±0.02a 0.71±0.04b 0.54±0.03b 6.111＜0.001 PI3K 蛋白0.42±0.02 0.15±0.01a 0.33±0.03b 0.28±0.02b 4.462 0.012

图1 各组大鼠子宫的组织学分析（HE 染色，×20）

注：A 为对照组；B 为模型组；C 为HBHP 组；D 为阳性组；HBHP 为何氏补肾厚膜方

2.4 各组大鼠子宫内膜AKT、PI3K mRNA 相对表达量比较 与对照组比较，模型组大鼠子宫内膜AKT、PI3K mRNA 相对表达量显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，HBHP 组和阳性组子宫内膜AKT、PI3K mRNA 相对表达量显著升高（P＜0.05），阳性组与HBHP 组比较无显著差异（P＞0.05）。见表3。

表3 各组大鼠子宫内膜AKT、PI3K mRNA 相对表达量比较（±s）

表3 各组大鼠子宫内膜AKT、PI3K mRNA 相对表达量比较（±s）

注：HBHP 为何氏补肾厚膜方；AKT 为蛋白激酶B；PI3K 为磷脂酰肌醇激酶；与对照组比较，aP＜0.05；与模型组比较，bP＜0.05

组别对照组模型组HBHP 组阳性组F 值P 值鼠数12 11 11 11 AKT mRNA 1.02±0.23 0.42±0.20a 0.97±0.33b 0.86±0.30b 11.612＜0.001 PI3K mRNA 1.06±0.35 0.58±0.22a 0.98±0.55b 0.87±0.33b 3.363 0.028

3 讨 论

本研究成功建立了95%乙醇诱导的TE 模型大鼠，通过HE 染色观察子宫内膜的厚度和形态，表明TE 模型大鼠建立成功。光镜检查显示，经95%乙醇灌注的模型组子宫内膜明显薄于对照组；HBHP 治疗后，子宫内膜厚度增加，腺体数量增加。因此，我们推断HBHP 改善TE 可能与促进子宫内膜腺上皮的生长和修复有关。

子宫内膜中PI3K/AKT 通路的表达受雌激素和孕激素的调节，可以将子宫内膜从薄而致密转变为厚而透明[7]。与女性激素结合，PI3K/AKT 通路可以在子宫内膜的增殖、分泌和脱落中发挥作用。月经期PI3K/AKT 通路的低表达水平与子宫内膜脱落有关，而分泌期PI3K/AKT 通路的高表达水平促进新血管形成和血管通透性，有助于修复子宫内膜和胚胎植入[8]。McCoski 等[9]研究发现，PI3K/AKT 通路在绵羊子宫内膜的整个着床窗口期均有表达，认为PI3K/AKT通路可能有助于子宫内膜容受性。本研究中PCR 和免疫组化结果显示，模型组PI3K/AKT 通路表达明显低于对照组正常子宫内膜。然而，在进行HBHP 治疗后，PI3K/AKT 通路的表达显著增加。因此，HBHP 可通过增加PI3K/AKT 通路的表达促进血管生成和局部血供，从而改善子宫内膜厚度和容受性。

中医学没有TE 的病名，根据其临床症状，可将其归属于“不孕”“月经过少”“闭经”等范畴。肾主生殖，肾精亏虚，精血无以滋养胞宫，而致子宫内膜变薄。HBHP 是何氏妇科多年经验的总结，方中紫河车为血肉有情之品，生精益血，温补肾阳，温和而滋养力强；鹿角片、仙灵脾温补肾阳，菟丝子、覆盆子、枸杞子、熟地、炒白芍补益肝肾，养血生精，当归、川芎、赤芍活血，香附理气；黄芪为补中升阳之要药，张锡纯谓其补益之功能生肌肉。全方补中有散，动静结合，温润并行，具有补肾、填精、活血、养血功效，诸药合用，不仅可以增加子宫内膜厚度，还可以改善缺血后子宫内膜血流，从而增加受精卵着床机会。

综上，目前的研究证实HBHP 可通过增强PI3K/AKT 通路来改善TE 模型大鼠的子宫内膜厚度和容受性，但是我们发现，HBHP 组与阳性组比较，PI3K/AKT 通路表达无明显差异的情况下，在增加子宫内膜厚度和腺体数量上优于阳性组，因此推断可能存在其他的信号通路。在未来的研究中，我们拟构建网络药理学分析和实验验证的综合策略来鉴定参与HBHP 对TE 有益作用的潜在活性成分和分子机制，并通过体外网络药理学和分子对接实验建立关键靶点和信号通道[10]。