青岛市胶州地区B(A)亚型患者的血型血清学及基因检测分析

秦洪伟 王小霞 阴瑞兰 张树超

(1.青岛大学基础医学院 免疫学系，山东 青岛 266071；2.青岛市胶州中心医院 输血科；3.青岛大学附属医院 输血科)

ABO 血型是发现最早也是最有临床意义的血型系统，ABO 同型输血是保障患者生命安全的不可替代的治疗方式[1]，而在临床ABO 血型检查过程中，偶尔会遇到ABO 正反定型不符的情况，导致不能在短时间内给出ABO 血型的具体结论，可能会对临床输血的时效性和安全性带来一定影响。ABO 亚型是导致ABO 正反定型不符的常见原因之一[2]，一般正定型会表现为红细胞上A 或B 抗原与单克隆抗-A 或抗-B 反应减弱。 我们对青岛市胶州地区检测发现的B(A)亚型进行血清学及分子生物学特点的回顾性分析，探讨B(A)亚型漏检对临床输血安全的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2019 年11 月至2023 年2 月来本院就诊进行ABO 血型检测的26 065 名患者，采用全自动微柱玻璃珠法进行ABO 血型检测，其中12 例标本ABO血型正反定型不符，疑似AB 亚型，进一步进行ABO 亚型检测及ABO 基因第6、7 外显子直接测序分析。

1.2 仪器与试剂

KA2200 型血型血清学专用离心机(日本KUBOTA 公司)，KA2420 型标本离心机(日本KUBOTA公司)，OrthoAutoVue 全自动血型仪(美国奥森多公司)，Ortho BioVue 离心机(美国奥森多公司)，Ortho BioVue 孵育器(美国奥森多公司)，DiaMed 离心机(瑞士达亚美公司)，ABI9700 基因扩增仪(美国ABI 公司)，ABI3730XL 测序仪(美国ABI 公司)。ABO 及RhD 血型定型试剂卡(批号:ABR143F、ABR243F、ABR317J、ABR347H、ABR356F，美国奥森多公司)；ABO 和RhD 血型检测卡(批号:50093.03.21，瑞士达亚美)；抗-A 试剂(批号:20210405、20220102 )、 抗-B 试 剂 ( 批 号: 20210405、20220102)、ABO 反定红细胞(批号:20215353 、20225305 、20227044、 20225356)、抗-H 试剂(批号:20201126)、抗-A1 试剂(批号:20201207)，均为上海血液生物医药；抗-A，B 试剂(批号:840000，法国DIAGAST 公司)；ABO 血型基因分型检测试剂盒(PCR-SBT 法)(批号:WC01U002001，江苏伟禾生物科技)；血液基因组DNA 提取试剂盒(批号:DP348，天根生化科技)。

1.3 血型血清学试验

ABO 血型鉴定试验采用OrthoAutoVue 全自动血型分析仪器的微柱玻璃珠法上机检测，ABO 正反定型不符分析的标本采用盐水试管法进行复核确认并增加抗-H、抗-A1、抗-A，B 试验、吸收放散试验，由于条件限制，部分标本增加DiaMed 微柱凝胶法ABO 血型正反定型。

1.4 ABO 基因检测

1.4.1 DNA 提取

采用血液DNA 提取试剂盒，按照试剂说明书进行DNA 提取，所得核酸标本A260/A280应介于1.6～2.0 之间。

1.4.2 ABO 基因第6、7 外显子直接测序

采用血型基因分型检测试剂盒的测序引物对Exon6 及Exon7 进行扩增。 对PCR 扩增产物进行凝胶电泳，对PCR 产物纯化后使用ABI3730XL 测序仪进行测序，保存测序结果，基因测序结果参照国际输血协会公布的最新数据采用BioEdit 软件进行比对分析，根据标本突变点读取ABO等位基因型别。

1.5 交叉配血试验

采用盐水试管法、微柱抗人球法分别进行主次侧交叉配血试验。

2 结果

2.1 B(A)亚型检出情况

12 例ABO 血型正反定型不符标本疑为AB 亚型，经过ABO基因检测确认，8 例血清学表现为AwB 的标本确认为B(A)亚型，2 例血清学表现为ABw的标本:1 例为AB 亚型、1 例为正常AB 型，2例血清学表现为AwBw的标本为正常AB 血型。ABO基因检测确认的9 例B(A)血型的等位基因型全部为BA.04，男性2 例，女性7 例，年龄16 ～70岁，平均年龄43.5 岁。 B(A)亚型检出率为0.345‰(9/26 065)。

2.2 血型血清学检测

9 例B(A)亚型标本的微柱玻璃珠法和盐水试管法检测结果见表1，增加抗-H、抗-A，B、抗-A1 检测、吸收放散试验。 1 ～8 号标本正定型表现为AwB，反定型表现为B 型，血清学符合B(A)亚型特点；9 号标本正定型表现为ABw，反定型表现为AB型，血清学符合ABw亚型特点，见表1。

表1 微柱玻璃珠法和盐水试管法ABO 血型血清学检测结果Table 1 Serological results of ABO blood group by microcolumn glass bead methods and saline tube methods

2.3 基因检测

9 例标本的ABO基因检测结果见表2，全部检测出BA.04 特征性的c.640A＞G 碱基突变，1 ～8 号标本全为BA.04 与O等位基因的杂合，9 号标本为A1.02 与BA.04 的杂合，检出的O等位基因型别为O.01.01、O.01.02、O.01.31。

表2 9 例标本的ABO 基因第6、7 外显子测序结果Table 2 Sequencing results of exons 6 and 7 of ABO gene in 9 samples

2.4 微柱玻璃珠法与微柱凝胶法检测对比

6、7、8 号标本采用某厂家微柱凝胶血型卡进行检测，对比微柱玻璃珠法与微柱凝胶法的检测结果差异。 微柱玻璃珠法ABO 血型正反定型不符，血清学反应格局为B(A)亚型表现，见图1；微柱凝胶法ABO 血型鉴定正反定型相符，血清学反应格局为B 型，见图2。

图1 微柱玻璃珠法B(A)亚型检测结果Figure 1 Detection results of B(A) subgroup by microcolumn glass bead methods

图2 微柱凝胶法B(A)亚型检测结果Figure 2 Detection results of B(A) subgroup by microcolumn gel methods

2.5 交叉配血结果

1～8 号患者血样随机与检测当天3 名B 型献血者去白细胞悬浮红血液进行交叉配血，主次侧相合，与3 例O 型洗涤红细胞配血，主侧相合；9 号患者血样随机与检测当日3 名AB 型献血者去白细胞悬浮红细胞进行交叉配血试验，主次侧相合，与3 例O 型洗涤红细胞洗涤红细胞主侧相合。

3 讨论

ABO 亚型通常表现为正定型A 或B 抗原的表达减弱、缺失或出现混合凝集，血型血清学方面表现为正定型凝集强度的减弱或无反应[3]。 ABO 血型正反定型不符是发现ABO 亚型的重要途径。ABO 亚型主要发生机制是A或B等位基因发生碱基突变，引起N-乙酰基半乳糖胺转移酶或α1，3-D-半乳糖转移酶空间结构的氨基酸改变，糖基转移酶的催化活性出现变化，有的甚至表现出双功能酶的活性[4]。 临床检测发现的ABO 亚型主要有A2、A3、Ax、Ael、B3、Bel、Bw、B(A)、cisAB 等[5-7]，现多数已阐明其分子生物学机制。

B(A)亚型是临床较罕见的ABO 亚型之一，最早由Yamamoto 等[8]于1985 年发现并于1993 年阐述其分子生物学机制。 B(A)亚型一般认为是遗传学上的B 型，主要血清学特点是红细胞上存在较多的B 抗原和少量的A 抗原，正定型与单克隆抗-A发生弱凝集，与抗-A1 不凝集，与单克隆抗-B 发生强凝集，与抗-H 反应强度较强，血清中含有较强的抗-A。 B(A)血型的等位基因与B等位基因序列基本一致，但是存在特定位置的单碱基突变，导致变异的等位基因编码表达A、B 双功能酶活性，红细胞表面不仅表达较多的B 抗原，还表达相对较少的A 抗原[9]。 目前，国际输血协会公布的B(A)血型等位基因型共6 种，即BA.01、BA.02、BA.03、BA.04、BA.05、BA.06[10]，其中BA.02、BA.04 ～BA.06 均是在中国人群中首先发现的[11]。 B(A)亚型的表型频率，在不同人群中略有不同，在中国总体发生率约为1/(5～10) 万，在高加索人种中约为1 /(17 ～58)万[12]。 目前关于B(A)亚型的研究以个案报道和相关家系调查研究为主[13-16]，我国人群中的B(A)血型的实际发生频率有待于多中心的联合调查研究。 本项研究发现，B(A)亚型在青岛市胶州地区的检出率为0.345‰(9/26 065)，远高于雷航等[3]的相关研究B(A)检出率(0.066‰)，提示B(A)亚型可能在胶州地区有较高的表型分布。

本次研究中，1～8 号标本血清学正定型表现为AwB、反定型为B 型的反应格局，血清学分析可能为B(A)亚型，进一步基因检测确认，8 例标本均为BA.04 等位基因与O等位基因杂合，与国内文献中对于B(A)亚型的基因检测报道一致[17-18]。 本次研究发现的B(A)亚型大多数是B(A)基因与O基因杂合，由于O基因是无效基因，B(A)基因的血清学AwB 表达特点能够充分展现。 9 号标本血清学正定型表现为ABw、反定型为AB 型的反应格局，血清学分析可能为ABw亚型，经过基因检测确认为BA.04 等位基因与A1.02 等位基因杂合。 传统理论认为B(A)基因与A基因共同表达时，血清学会判为正常AB 型而出现漏检现象[19]。 而本项研究中，在ABw血清学表型中发现的BA.04 基因与A基因的杂合现象，比较罕见，出现血清学表型与基因型不一致，提示可能存在的B(A)等位基因与A等位基因的竞争作用，也有可能是B(A)等位基因表达的B 糖基转移酶本身反应活性较弱所致[20]。

对比某厂家微珠玻璃珠血型卡和某厂家微柱凝胶血型卡对3 例B(A)亚型样本的检测结果，发现反应格局有一定差异。 由于客观条件限制，未对其它样本B(A)亚型样本进行微柱凝胶法检测，不同血型检测卡对B(A)亚型样本的检测是否有差异和临床意义还需要更多样本的观察研究。 相关文献提示，B(A)血型具有与不同单克隆抗-A 试剂反应性不同的特点，采用含有鼠源MHO4 的单克隆抗-A 对B(A)亚型表达的弱A 抗原具有较好的反应性[21]。 所以，在临床工作中，我们需要去了解不同克隆株单克隆抗体对不同血型抗原的检测差异，拓展ABO 血型正反定型不符分析思路。

ABO 亚型的输血，短时间内找到同型的血液比较困难，如果输血一般建议选择O 型洗涤红细胞和AB 型血浆[22]。 为研究B(A)亚型漏检和紧急抢救时输注B 型去白细胞悬浮红细胞的安全性，对8 例B(A)血型标本与随机3 例B 型去白细胞悬浮红细胞进行交叉配血，配血结果是相合的，人源性的抗-A 与B(A)型的弱A 抗原没有检测到反应性，可能跟人源性抗体效价和B(A)型弱A 抗原为冷反应性有关[16]。 周国栋等[23]对1 名颅脑外伤B(A)亚型患者进行紧急输注4 U 交叉配血主次侧相合的B 型去白细胞悬浮红细胞，结果显示红细胞输注有效，无输血不良反应。 对于B(A)血型输注B 型悬浮红细胞的安全性，我们认为在B(A)亚型漏检不知情和紧急情况下，选择交叉配血相合的B型去白细胞悬浮红细胞是安全的。

综上所述，青岛市胶州地区发现的B(A)亚型等位基因型主要为BA.04。 血清学表型与基因型会存在不一致现象，在ABw血清学表型中，可能存在B(A)血型等位基因，B(A)亚型的发现需要血清学的初筛与分子生物学检测的确认。 对于B(A)亚型患者的红细胞输注，紧急情况下可选择交叉配血相合的B 型去白细胞悬浮红细胞，非紧急情况下可选择O 型洗涤红细胞或自体输血的方式。

利益冲突说明/Conflict of Interests

所有作者均声明不存在利益冲突。

伦理批准及知情同意/Ethics Approval and Patient Consent

本研究经过青岛市胶州中心医院伦理委员会批准(伦理号:20230501)。 本研究纳入的所有患者，其本人或家属均签署了知情同意书。

作者贡献/Authors' Contribution

秦洪伟:文献检索、数据分析、文章撰写、论文修改；王小霞:实验实施、数据整理、图片采集；阴瑞兰:实验实施、数据整理；张树超:研究设计、技术指导、写作指导、文章审阅。