茶叶制备血管紧张素转换酶抑制肽可行性及功能分析

李 丽，陈 洁

（南华大学附属第二医院，湖南 衡阳 421001）

中国是全球第一大茶生产大国，2017年度，干茶总产量达到258万吨。在对茶进行深加工的研究中，茶的深加工范围也在持续扩大，速溶茶、茶饮料以及茶多酚等茶深加工产品的产量在快速地增加。在我国，由于我国茶园的规模不断扩大，在生产中会产生大量的残留物。因此，对其进行高效处理，将其转化为可再生资源，成为当前急需突破的技术难题。

1 研究意义

在全世界范围内，每年都有越来越多的人患上高血压，这给卫生体系带来了很大的挑战。因此，对高血压病的预防和治疗一直是医学领域的一个难点。将具有降压作用的天然植物蛋白质转化为具有降压功效的多肽，以其为原料，研制成功能化的药物已成为当前的研究和发展方向。茶叶活性物质是一种具有最大保健作用的天然物质，其活性物质如茶多酚、茶黄素、茶多糖、茶氨酸等与人体健康有关的科研报告也在不断增多[1]。茶中所含的各种活性物质对身体具有一定的保健作用，对其进行合理的开发和应用已成为国际上的一个热门话题。

中国是茶的起源地，也是全球首位的种植和生产大国。近年来，随着茶叶的种植面积和产量的不断扩大，每年都会生产出大量的茶和深加工后产生的废料，也说明了我国拥有丰富的茶叶蛋白资源。研究者在前期工作的基础上，通过分离纯化茶叶中的蛋白质，利用酶水解法，从茶叶中分离得到的 ACE抑制多肽，并通过动物实验验证其降压效果，阐明其降压机理，为进一步研发新型的茶叶降压多肽产品奠定基础，同时也可以进一步拓展茶叶深加工产品种类，降低茶叶资源的浪费，提高茶叶的附加值，延长茶叶产业链，提高人们的体质和体质，从而推动我国茶叶产业快速发展[2]。

2 ACE抑制肽的来源及结构

早在1965年，Ferreira等人从蛇毒中首次发现了 ACE抑制多肽，并以其为模式药物，开发了一系列的ACE抑制剂，其中包括目前仍然被广泛应用的卡托普利。在1979年，Oshinma等人利用细菌的胶原蛋白对明胶进行降解，得到了6个活性很高的ACE抑制多肽。蛋白质来源是决定酶水法合成降压多肽的活性及收率的重要因素，但因蛋白质结构差异，导致其酶水法合成降压多肽，其降压作用也不尽相同。多肽的分子质量通常低于10kDa，含有不超过100个氨基酸，其抗肿瘤作用的强弱与多肽的分子质量及氨基酸组成密切相关。已有研究显示，分子质量小于1kDa的多肽碎片，其降压效果更好。通常情况下，具有较多的疏水氨基酸，尤其是具有较高的酪氨酸，具有较好的降压作用。尽管疏水型氨基酸不会提高多肽在水相中的溶解性，但是却可以提高多肽在油脂环境中的溶解性，从而提高多肽的降压效果。肽段的C端为脯氨酸或芳香族氨基酸，具有良好的降血压作用，N端为长链或含支链的疏水性氨基酸，具有良好的降血压作用，N端为脯氨酸则具有一定的降压作用。此外，已有报道显示，ACE抑制剂的活性与其结构具有较强的相关性[3]。

3 ACE抑制肽制备方法

3.1 超滤

超滤是一种以高压为驱动力的膜分离技术，在多种生物大分子、多种小分子的分级分离、浓缩以及海水淡化等方面有着重要的应用。杜璟等人采用超滤法制备了一种含有3ku分子量的多肽水溶液，其ACE抑制效果最好。前期研究发现，在3ku的超滤层中，双低型小白菜的降压活性显著增强，其渗透物IC50降低15%。利用10kDa、3kDa的超滤膜对条斑紫菜降压肽段进行了研究，发现其ACE抑制活性在3kDa以下，其IC50从0.844mg/mL下降到0.523mg/mL。采用超滤技术从豇豆中提取降压多肽，结果表明，在1kDa以下的超过滤组分具有较好的降压效果。

3.2 凝胶色谱

凝胶层析技术是基于蛋白质网络的特点，依据蛋白质分子大小和形状的不同，将蛋白质分子从蛋白质网络中分离出来的一种新方法。目前，凝胶层析技术已被广泛应用于降压活性多肽的研究。在大气压下，通常使用的是琼脂糖（SePHadex)G-15、G-25以及聚丙烯酰胺（Biogel）的Bio-gelP-2、P-4、P-6、P-10等多种形式的葡萄糖（gel）作为大气压下的凝胶层[4]。

利用凝胶电泳（SePHadex）G-25对米糠蛋白水解液进行了分离，获得了3个组分，分别是F2（IC50=0.24mg/mL）和ACE（IC50=32µg/mL），对DPPH自由基的清除作用最大。使用SePHadexLH-20凝胶过滤色谱对牡蛎蛋白水解产物进行了分离，得出三个组分的IC50值分别为1.2mg/mL、0.49mg/mL和0.53mg/mL。使用凝胶过滤色谱的方法，对鸡蛋水解产物进行了分离，从而获得了高活性的ACE抑制肽，并对其中一种肽的氨基酸序列进行了分析，得出Arg-Val-Pro-Ser-Leu的结果。

4 茶叶蛋白研究现状

我国茶树资源丰富，茶叶生产历史悠久。茶叶是中国的一种传统和特色的农业经济作物，茶叶种类繁多，茶叶产地面积广阔，中国是全球最重要的茶叶生产国、出口国和消费国。茶叶生物化学组分种类繁多，蛋白质含量高达20%-30%，但大部分非水溶性，只有1%-2%的蛋白质属于可溶蛋白。从远古时代起，茶就被人类用作药材，并得到了广泛的应用。近年来，随着现代科技的进步，以及对茶树生化、药理学等方面的研究，对茶树营养物质的健康作用也日益引起了人们的重视。茶蛋白质中约80%为大分子，且谷蛋白与谷蛋白之间存在二硫键与疏水性官能团的相互作用，导致其不易溶于水，不易被人体吸收，极大地制约了茶蛋白质的应用[5]。

5 茶叶蛋白的制备

5.1 茶叶蛋白的提取

从植物中分离出蛋白质主要有碱法、酸法和酶法。茶叶中含有超过80%的碱可溶蛋白质，碱性溶液可以解离茶素中的极性基，使其表面电荷趋于一致，打破蛋白质间的氢键，提高其溶解度，提高其萃取效率。在此基础上，提出了一种新的茶树籽蛋白萃取方法，其萃取效率可达61.86%，而在超声技术的帮助下，将茶树籽蛋白萃取效率从单纯的碱萃取方法的49.3%提升至86.5%。虽然采用碱法制备的茶树蛋白质产量高、生产费用低廉，但需采用高碱含量时，才能得到高得率[6]。

在碱性溶液中，高含量的碱性溶液使其营养性质改变，并产生赖-丙氨酸等有毒化合物，使其营养成分流失。另外，在高密度的碱性溶液中，容易导致蛋白质和糖类等产生美拉德反应，造成茶叶蛋白质的不可逆变性，并导致了某些非蛋白质的溶解，从而增大了蛋白质的分离难度。研究结果显示，在 PH高于7.0后，茶叶蛋白提取率会随着PH升高而提升。但是，盐析后的蛋白质沉淀物并不容易对其进行脱色，而且蛋白质容易与茶多酚形成具有较低营养价值的沉淀。

在酶法中，利用到的酶以蛋白酶为主，蛋白酶可以对茶叶中的蛋白质进行改性和降解，从而使得其肽链缩短，分子量减小。利用蛋白酶对茶中蛋白质进行降解，并对与之连接的其他成分进行降解，可加快茶中蛋白质的溶解速度。相对于碱浸出，酶浸出工艺要求较低，且不会造成对蛋白养分的损伤，能够最大限度地保持蛋白的营养和功能性[7]。

结果表明，采用碱性蛋白酶对茶树中的蛋白质进行了萃取，萃取得率可达34.2%。当前，茶树中蛋白质的酶法制备技术还不够完善，存在着得率不高、成本高等问题，限制了该技术的工业化推广。拟通过对茶树中蛋白质的酶学性质等方面的深入探索，进一步完善茶树中蛋白质的酶学性质，为茶树中蛋白质的产业化提供理论依据。

复合工艺是将酶法和碱法结合在一起的一种工艺，也就是采用一次用碱液或酶液来一次提取茶叶蛋白，然后用另外一种工艺来二次提取茶叶蛋白。该方法仅用少量的碱性溶液，就可以获得很高的蛋白浸出率，并且保留了茶树蛋白原有的营养和功能性。利用碱溶法、酶水法、酸水法分别对茶叶蛋白质进行处理，得到了茶叶蛋白质，具体公式为：

萃取得率=（蛋白质质量/茶叶质量）×100%（1）

5.2 茶叶蛋白的纯化

目前，对茶中蛋白质的研究主要集中在三个方面，即沉淀、脱色和淡化。因为在沉淀后的茶叶蛋白仍然具有较深的颜色，所以在沉淀后，还需要对茶叶蛋白进行脱色，其中的脱色方法主要有：有机溶剂脱色法、活性炭吸附法和过氧化氢脱色法等。用水提取法可以除去因茶树褐色而引起的水溶性黑色素。目前，活性碳虽能对颜料进行有效的吸收，但其对颜料的选择能力较差，易导致一些已解离态的蛋白在其表面被吸附，导致蛋白丢失。而在有机试剂萃取法中，大多以丙酮为主，通过丙酮洗脱后，所获得的茶叶蛋白的脱色效果十分显著。与此同时，丙酮还可以被循环使用，与活性炭脱色的方法相比，丙酮清洗脱色法获得的茶叶蛋白的提取率也比较高。

5.3 茶叶蛋白的功能性质

除了具有一定的营养价值之外，还具有其它一些理化特性，例如溶解性，起泡性，乳化性，粘度等。蛋白的功能特性对食物的感觉品质有很大的影响，在食物的制备、加工和储存等环节中，蛋白的理化性能也会有很大的改变，这也是蛋白制品在食物中的运用的一个关键问题。很多蛋白质的内部因素都会对其的功能特性产生影响，具体有：蛋白质的大小、形状、结构、疏水性与亲水性之比、氨基酸组成与序列、分子的柔性与刚性、静电荷的分布以及分子之间的相互作用等。

外部环境也会对蛋白质的功能特性产生影响，比如温度、盐浓度、PH值、压力、贮存条件等，都会导致蛋白质的功能特性发生变化。根据调查显示，在等电点（PH4.0）附近，茶渣蛋白的溶解性是最低的，其乳化性及乳化稳定性随着 PH的变化而与溶解性呈现出同样的趋势，在等电点附近，其起泡稳定性也是比较好的，其吸油性为0.85g油/g蛋白，其吸油性比大豆蛋白粉要好，但是比大豆分离蛋白要差。

6 高血压及其治疗方式

高血压作为一种常见病，并可导致脑、心、肾等多个靶组织的损伤，是导致心血管病致死的重要因素。不断增长的血压升高对全球卫生体系提出了巨大挑战，数据显示，2015年世界范围内，高血压患病人群约为11.3亿，而在中国，高血压病人数量更是突破了两亿。所以，对其防治一直是医学领域的一个难点问题，对高血压的药物和治疗的研究也越来越多。钙通道阻断剂、血管紧张素转换酶抑制剂、β-受体阻断剂、血管紧张素Ⅱ受体阻断剂、利尿剂等都是临床上比较常见的降压药物。这几种降压药的降压作用都很好，但是它们都有一些不良反应，或者是不适合特定的人群，所以它们的持续使用会有一些局限性[8]。

比如，β-受体阻断剂会引起眩晕、胃肠紊乱、对糖脂代谢产生影响，所以不适用于鼻窦性心动过缓、重度房室传导阻滞和支气管哮喘患者，ACE抑制剂药物会引起无痰干咳或血管性水肿，活动性肝炎、肝病患者、高钾血症、严重肾功能损伤以及怀孕早期等也都不适用。从植物和动物中，开发出一种安全有效、毒副作用小，可以替代西药的天然降压活性物质，正日益被研究者们所重视。对食源性多肽进行研究，并开发出一种能够帮助或替代高血压药物的功能食品，这对于高血压的防控具有十分重大的意义[9]。

7 高血压的抑制机理

高血压的发生与遗传、环境及其它多种原因有关，例如：高盐摄入，交感神经活动增强，饮食中钾钙摄入不足，内皮功能受损，RAS活性增高，血管阻力增高，VGF活性增高，VEGF活性升高，血管阻力升高，血管生长因子活性增高等。自1952年Skeggs LT等人首先阐明Respons-Angiogenesis系统并阐明其在心血管中的重要调控功能以来，并对这一内分泌系统的构成和功能进行了广泛研究。

AngII作为 RAS系统的关键组分，可通过活化 AngII Type1，增加glycine glycin分泌，增加交感神经活性，从而引起血压升高。AngII还可以活化肾脏中的AT1，刺激肾上腺的醛固酮的分泌，或者是通过中枢神经系统引发口渴，进而对钠和水的再吸收产生影响，进而对血压进行调控[10]。

8 结语

高血压作为一种常见病，可促进AS进展或提高其对AS的易感，并可导致脑、心、肾等多个靶组织的损伤，是导致心血管病致死的重要因素。从茶叶开发出一种安全有效、毒副作用小，可以替代西药的天然降压活性物质，正日益被研究者所重视。对食源性多肽进行研究，并开发出一种能够帮助或替代高血压药物的功能食品，这对于高血压的防控具有十分重大的意义。