冷冻调理小龙虾生物保鲜剂的筛选及复配

孙英杰，孙荣雪，王成，马艳弘，熊令明，刘钱媛，江宁*

（1.江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014）

小龙虾原名克氏原螯虾，甲壳纲、十足目，因其独特的风味、高蛋白和低脂肪含量等优点深受广大消费者喜爱，是我国畅销的淡水虾类[1-2]。随着小龙虾消费量的迅速增长，小龙虾加工品类日益多样化、特色化，主要包括生鲜食品、冷冻初加工或低温熟食制品等[3]。其中，冷冻调理小龙虾因经简单加工后便可食用而具有广阔的发展前景。但冷冻处理只是抑制微生物繁殖及酶的活性，贮运过程的温度波动、贮运时间等都会对小龙虾产品品质造成不同程度的影响[4]。除此之外，冷冻调理小龙虾在加工过程中使用大量油脂，产品在冻藏过程中易氧化加剧，最终引起产品劣变。

生物保鲜剂是一种绿色、安全且高效的新型保鲜剂，其主要从动物、植物和微生物中获得[5]，具有绿色安全、残留量低和保鲜能力强等特点，是现代食品保鲜的研究热点。聚赖氨酸盐酸盐是链霉菌属发酵过程中的代谢产物，经提取分离精制获得，是一种具有广谱抑菌性和热稳定性的新型生物保鲜剂[6]。刘文浩等[7]研究发现，ε-聚赖氨酸盐酸盐使用量在0.1～0.3 g/kg 范围内，对弗氏柠檬酸杆菌属的抑菌率达到100%。于晓慧等[8]选用茶多酚为主的生物保鲜剂处理小龙虾后发现，样品微生物数量和挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）值的增长速率均有所降低，且在（25±1）℃贮藏条件下，货架期由6 d 延长至15 d。迷迭香提取物具有高抗氧化活性，并且有相关研究表明，经含迷迭香提取物处理的鸡肉饼保质期延长了4 d[9]。相关研究发现，将生物保鲜剂组合后应用于肉制品，能够有效抑制其微生物生长和脂质氧化[10-11]。

本研究对7 种生物保鲜剂进行筛选，通过响应面法对筛选得到的生物保鲜剂进行复配，并对优化得到的复合保鲜剂保鲜能力进行验证，以期为复合生物保鲜剂在延缓冷冻调理小龙虾脂质氧化和品质劣变等方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活小龙虾：淮安洪泽湖渔夫有限公司；腐败希瓦氏菌：江苏省农业科学院农产品加工研究所；聚赖氨酸盐酸盐（polylysine hydrochloride，PL）、茶多酚（tea polyphenols，TP）、迷迭香提取物（rosemary extracts，RE）、乳酸链球菌素（Nisin）、葡萄籽提取物、苹果多酚、褐藻寡糖（Mw=2 800 Da）（均为食品级）；无水乙醇、醋酸钠、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺盐[diammonium2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate），ABTS]、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、过硫酸钾、氯化钠（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；总抗氧化能力测定试剂盒：南京建成海浩生物科技有限公司

1.2 仪器与设备

M4PC 型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；XO-6D 无菌均质器：南京先欧仪器制造有限公司；SPARK 酶标仪：帝肯奥地利有限责任公司；5424R 高速冷冻离心机：湖南湘仪有限公司；SW-CJ-1F超净工作台：苏州净化有限公司；HZQ-F100 全温度振荡培养箱：太仓市华美生化仪器厂；SN-HWS-250B 恒温恒湿箱：上海尚普仪器设备有限公司；LDZM-80L-I立式高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 冷冻调理小龙虾的制备工艺

将新鲜小龙虾刷洗干净后置于碎冰中猝死，并于室温下静置1 h 以沥干水分，随后置于160 ℃油炸锅中炸制2～3 min。将油炸后的小龙虾加入卤汁中煮制8 min。待小龙虾卤汁冷却到80 ℃，加入不同浓度的保鲜剂并浸渍1 h，最后对小龙虾进行真空包装，经机械速冻后于-18 ℃冰柜中贮藏，备用。

1.3.2 生物保鲜剂体外抗氧化能力测定

经文献查阅和前期预试验发现，聚赖氨酸盐酸盐、乳酸链球菌素两种抑菌剂的抗氧化能力极其微弱，因此不参与体外抗氧化能力的测定，仅对迷迭香提取物、茶多酚、苹果多酚、葡萄籽提取物、褐藻寡糖5 种生物保鲜剂进行抗氧化试验。

1.3.2.1 DPPH·清除活性

参考马剑等[12]的方法，并略作修改。取50 µL 生物保鲜剂与150 µL 0.1 mmol/L DPPH 溶液混合均匀，室温下避光放置30 min 后，测定其在517 nm 处的吸光度，以无水乙醇做空白对照。DPPH·清除率（X，%）计算公式如下。

式中：Ai为试验组吸光度；Aj为对照组吸光度；A0为空白组吸光度。

1.3.2.2 ABTS+自由基清除活性

参考Feng 等[13]的方法，并略作修改。20µL 生物保鲜剂与180 µL ABTS+工作液，室温避光反应60 min。以蒸馏水为空白对照，在734 nm 处测吸光度。ABTS+自由基清除率（Y，%）计算公式如下。

式中：A0为试验组吸光度；A1为空白组吸光度。

1.3.2.3 总抗氧化能力总抗氧化能力参考总抗氧化能力测定试剂盒说明书的方法进行测定。

1.3.3 抑菌能力测试

参考Tian 等[14]的方法，取典型腐败菌菌悬液0.1 mL涂布，使用打孔器在培养基上等距打孔，每孔中加入50 µL 生物保鲜剂进行抑菌能力测定，以无菌水为对照，37 ℃培养24 h，测量抑菌圈直径。

1.3.4 单因素试验

挑选鲜活、肢体无残缺且大小均匀（18±2）g 的小龙虾按照1.3.1 加工工艺进行处理。其中，单因素试验使用的保鲜剂为经过抑菌能力和体外抗氧化试验筛选所得（PL、RE、TP），处理组则不添加任何生物保鲜剂。各生物保鲜剂的最大限量标准参考GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[15]。单因素试验以为硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid-reactive substances，TBARS）值为指标，检测方法参考GB 5009.181—2016《食品安全国家标准食品中丙二醛的测定》[16]中第二法测定。样品每5 d 测定一次，15 d 为检测终点。试验重复3 次，结果取平均值。

1.3.5 响应面优化试验设计

为进一步优化复合生物保鲜剂中各组分的添加量，在单因素试验的基础上，综合选取作用效果最为明显的3 个添加量为考察因素，根据Box-Behnken 试验设计原理，设计三因素三水平试验。检测指标为贮藏15 d 后的TBARS 值、TVB-N 值，具体因素及水平如表1 所示。

表1 因素及水平编码Table 1 Coded levels for factors in Box-Behnken design

1.4 冷冻调理小龙虾贮藏期间理化指标测定

TVB-N 值：参考GB 5009.228—2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[17]中第三法进行测定。

TBARS 值：参考GB 5009.181—2016《食品安全国家标准 食品中丙二醛的测定》[16]中第二法测定。

菌落总数：参考GB 4789.2—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[18]测定。

1.5 数据处理

所有试验均重复3 次，试验结果取平均值，数据采用Origin 2021 与Design Expert V8 进行数据分析和图表绘制。采用SPSS 26 进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 抗氧化剂能力测定

2.1.1 DPPH 自由基清除率

在有生物保鲜剂存在时，DPPH 的孤对电子被配对，使其吸收值透射率弱或者消失，从而量化其抗氧化能力[19]。不同生物保鲜剂DPPH·清除率见图1。

图1 不同生物保鲜剂DPPH·清除率Fig.1 Different bio-preservative of DPPH·radical scavenging rate

由图1 可知，茶多酚、葡萄籽提取物表现出较强DPPH 自由基能力，添加量为0.062 5 g/L 时，自由基清除率分别达54% 和43%，高于其它生物保鲜剂的DPPH 自由基能力；迷迭香提取物DPPH 自由基清除效果受添加量影响较大，当添加量为1.5 g/L 时，茶多酚、葡萄籽提取物对DPPH 自由基清除率作用效果相当；而苹果多酚与褐藻寡糖DPPH 自由基清除率较低且浓度依赖性较弱，与古绍彬等[20]所测苹果多酚具有较强抗氧化作用有所差异，可能是由于苹果多酚纯度不同引起的差异。

2.1.2 ABTS+自由基清除率

ABTS 法测定生物保鲜剂的抗氧化作用主要是基于氢电子转移机制，即抗氧化剂为自由基底物提供一个氢原子，产生非自由基底物和抗氧化剂自由基[21-22]。不同生物保鲜剂ABTS+自由基清除率见图2。

图2 不同生物保鲜剂ABTS+自由基清除率Fig.2 Different bio-preservative of ABTS+radical scavenging rate

由图2 可知，保鲜剂添加量为1.0 g/L 时，茶多酚和迷迭香提取物ABTS+自由基清除率较高，可达到91.03% 和70.96%，这可能由于茶多酚和迷迭香提取物中的酚类物质能提供较多的氢原子。葡萄籽提取物ABTS+自由基清除活性受添加量影响较大，当生物保鲜剂浓度高于0.5 g/L 时，清除率大于迷迭香提取物。

2.1.3 总抗氧化能力

不同生物保鲜剂总抗氧化能力见图3。

图3 总抗氧化能力Fig.3 Total antioxidant capacity

由图3 可知，茶多酚总抗氧化能力较强，高于其它生物保鲜剂。同时，其它4 种物质具有剂量依赖性，总抗氧化能力均随添加量升高而增强。褐藻寡糖与迷迭香提取物总抗氧化能力差异不大，且添加量超过0.5 g/L时，这两种对总抗氧化能力影响较小。当葡萄籽提取物添加量小于1.0 g/L 时，其总抗氧化能力随添加量增加而增强。

综上所述，茶多酚和迷迭香提取物在低于最大允许添加量时，其DPPH 自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、总抗氧化能力优于其它生物保鲜剂。因此，选择这两种生物保鲜剂作为抗氧化剂进行复合生物保鲜剂的复配。

2.2 抑菌能力测定结果

单一保鲜剂对腐败希瓦氏菌的抑菌圈直径见表2。

表2 单一保鲜剂对腐败希瓦氏菌的抑菌圈直径Table 2 Diameter of inhibition zone of preservatives against Shewanella putrefaciens

由表2 可知，当乳酸链球菌素添加量低于4.00 g/L时，其对腐败希瓦氏菌的抑菌效果不显著且低于茶多酚，因而不作为抑菌剂参与单因素试验；聚赖氨酸盐酸盐添加量为4.00 g/L 时，其抑菌圈直径高达13.91 mm，相较于其它生物保鲜剂，对小龙虾典型腐败菌腐败希瓦氏菌生长繁殖表现出最佳抑制效果。可能是由于聚赖氨酸盐酸盐改变了腐败希瓦氏菌细胞膜通透性并破坏细胞壁，从而产生较大抑菌圈[6]。同时，茶多酚、迷迭香提取物所含有的酚类和黄酮类物质损伤通过腐败希瓦氏菌的细胞膜，干扰菌体正常生命活动，达到优于苹果多酚、葡萄籽提取物、褐藻寡糖的抑菌效果。结合抗氧化试验结果，茶多酚、迷迭香提取物可与聚赖氨酸盐酸盐进行复配优化，可用于延长冷冻调理小龙虾货架期。

2.3 单因素试验

丙二醛是脂质氧化的最终产物，丙二醛含量常用来反映机体氧化受损程度，其含量可用硫代巴比妥酸值表示。生物保鲜剂通过与脂质氧化过程中产生的金属离子及自由基结合，抑制原料自氧化反应的进行[23]。因此，选用TBARS 值作为生物保鲜剂对冷冻调理小龙虾脂质变化试验的测定指标。

图4 为不同PL 添加量对贮藏期间冷冻调理小龙虾TBARS 值的影响。

图4 不同PL 添加量对贮藏期间小龙虾TBARS 值的影响Fig.4 Effect of different concentrations of polylysine hydrochloride on TBARS value of crayfish during storage

由图4 可知，贮藏第15 天，各试验组TBARS 值均低于对照组（1.733±0.142）mg MDA/kg。在相同贮藏时间下，TBARS 值随PL 添加量的增加而减少，表明冷冻调理小龙虾脂质氧化速率与PL 添加量呈正相关。但添加量为0.25 g/L 与0.30 g/L 差异不明显，因而选择PL 添加量0.15、0.20、0.25 g/L 进行响应面优化试验。

不同TP 添加量对贮藏期间小龙虾TBARS 值的影响见图5。

图5 不同TP 添加量对贮藏期间小龙虾TBARS 值的影响Fig.5 Effects of different concentrations of tea polyphenols on TBARS value of crayfish during storage

由图5 可知，随贮藏时间的延长，TBARS 值逐渐增加，但经保鲜剂处理后的冷冻调理小龙虾TBARS 值始终低于CK 组。这可能是由于不饱和脂肪酸产生的自由基被TP 提供的氢原子猝灭，自由基链式反应中断，最终抑制MDA 生成[24]。TP 添加量为0.30 g/L 时，小龙虾贮藏第15 天时MDA 含量最低。而添加量为0.1 g/L 时对氧化作用的抑制效果略低于0.15 g/L，为使响应面结果更加精准，选用0.15 g/L 作为TP 添加量的最低值。TP 添加量为0.3 g/L 虽具有最好的延缓脂质氧化效果，但由于其在食品中的最大添加量为0.3 g/L，因此，综合食品安全和生产成本考虑，选择TP 添加量0.15、0.20、0.25 g/L 进行响应面优化试验。

不同RE 添加量对贮藏期间小龙虾TBARS 值的影响见图6。

图6 不同添加量RE 对贮藏期间小龙虾TBARS 值的影响Fig.6 Effects of different concentrations of rosemary extract on TBARS value of crayfish during storage

由图6 可知，RE 能明显减缓小龙虾贮藏期间TBARS 值的增加。RE 添加量为0.10 g/L 时，TBARS含量高于添加量为0.15 g/L 处理组，可能是RE 添加量较低，且冷冻贮藏过程中氧化反应较慢。添加量为0.3 g/L 时，TBARS 值最低，这可能是由于RE 中含有的迷迭香酸、鼠尾草酸等酚酸类物质在较高添加量下加强了对脂质氧化的抑制作用。因而选择迷迭香提取物添加量0.150、0.225、0.300 g/L 进行响应面优化试验。

2.4 响应面法优化保鲜剂复配比

2.4.1 响应面试验方案及结果

在单因素试验的基础上，选取PL 添加量、TP 添加量、RE 添加量为因素，以TBARS 值、TVB-N 值为响应值，进行三因素三水平的响应面优化试验，测定结果如表3。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Response surface design and results

2.4.2 响应面数学模型建立与显著性检验

使用Design-Expert V8 统计分析软件对表3 中的试验结果进行线性二次多项式回归拟合，得出TVB-N值（Y1）和TBARS 值（Y2）对PL（A）、RE（B）、TP（C）的二元多次回归方程分别为Y1=5.22-0.188 8A-0.282 5B-0.134 9C-0.139 8AB+0.152 0AC+0.060 7BC+1.33A2+0.499 0B2-0.086 3C2；Y2=0.372 4-0.056 9A-0.035 0B-0.028 6C+0.035 0AB-0.021 8AC+0.027 0BC+0.274 9A2+0.122 2B2-0.001 6C2。

以TVB-N 值和TBARS 值为响应值的响应面数学模型结果见表4。

表4 模型和回归系数显著性检验Table 4 Model and regression coefficient significance test

由表4 可知，以TVB-N 值为响应值时，该模型与TVB-N 值间的线性关系极显著，真实可靠（P＜0.000 1）。同时，TVB-N 模型失拟项F值为0.146 6，P值为0.926 7（P＞0.05），说明试验数据无异常点，误差较小。对TVBN 值模型的F值进行排序可知，各保鲜剂对冷冻调理小龙虾贮藏过程中影响顺序为RE（B）＞PL（A）＞TP（C）。以TBARS 值为响应值时，该模型与TBARS 值间的线性关系极显著（P＜0.000 1）。同时，TBARS 模型失拟项F值为5.95，P值为0.058 8（P＞0.05），说明该数学模型试验值与预测值有高度的相关性，可用于贮藏过程中冷冻调理小龙虾TBARS 值变化的理论预测。由F值可知，各保鲜剂对冷冻调理小龙虾贮藏过程中TBARS 值的影响顺序为PL（A）＞TP（C）＞RE（B）。综上可知，A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2对TVB-N 值的影响极显著，表明PL 与RE、TP 之间交互作用显著。A、B、C、A2、B2对TBARS 值的影响极显著，AC、BC对TBARS 值影响显著，表明PL 和TP、RE 和TP 在抑制TBARS 产生方面交互作用显著。

2.4.3 响应面分析

3D 图可直观地反映复合保鲜剂对冷冻贮藏过程中小龙虾TVB-N 值、TBARS 值的抑制效果。结合表4可知，以TVB-N 为响应值时PL 与RE、PL 与TP 交互作用显著；以TBARS 为响应值时，PL 与TP、RE 与TP之间交互作用显著。3 种生物保鲜剂添加量之间的具体交互作用见图7。

图7 因素交互作用图Fig.7 Effects of factor interactions on the quality of crayfish during storage

经响应面分析得到，复合保鲜剂最佳添加量为PL0.207 g/L、RE0.237 g/L、TP0.205 g/L，此条件下贮藏15 d 后，冷冻调理小龙虾TVB-N 值、TBARS 值分别为5.133 mg/100 g 和0.352 mg MDA/kg。考虑实际操作，将试验条件修正为聚赖氨酸盐酸盐添加量0.20 g/L、迷迭香提取物添加量0.23 g/L、茶多酚添加量0.20 g/L，此条件下进行3 次平行试验，小龙虾冻藏15 d 后测得TVB-N 值为（5.258±0.289）mg/100g，TBARS 值为（0.409±0.035）mg MDA/kg，与理论值无明显差异，说明该模型真实可靠。

2.5 冷冻调理小龙虾贮藏期间理化指标

在响应面试验得出的最佳生物保鲜剂添加量下，对冷冻调理小龙虾贮藏期间理化指标进行测定，结果见表5。

表5 验证试验Table 5 Validation tests

TVB-N 值是监测肉制品新鲜度和货架期的重要指标之一，与内源酶活性和微生物生长呈正相关[25]，新鲜肉中TVB-N 值应小于20 mg/100 g，随着新鲜度的下降，其值会逐渐增加。由表5 可知，经复合生物保鲜剂处理的小龙虾贮藏60 d 后TVB-N 值增加至7.187 mg/100 g，较空白组低19%，表明复合生物保鲜剂减缓了蛋白质的降解速度。这种差异可能是由于复合生物保鲜剂对细菌种群和蛋白质的抑制作用[9]。冷冻调理小龙虾贮藏60 d 后，空白组和生物保鲜剂组TBARS 值分别为0.669 mg MDA/kg 和0.602 mg MDA/kg。由于复合生物保鲜剂含有的酚酸、黄酮类物质可与氧化过程中产生的自由基、金属离子进行结合，从而阻碍了MDA 的产生和积累。两种处理方式下，菌落总数变化趋势较为平缓，可能是由于熟制过程杀死部分微生物，冻藏环境使得微生物生长缓慢。小龙虾贮藏60 d 后，生物保鲜剂处理组TBARS 值、TVB-N 值、菌落总数均低于空白组，表明复合生物保鲜剂可在一定程度抑制贮藏期间冷冻调理小龙虾氧化反应和微生物活动，阻碍其腐败变质。

3 结论

本研究通过体外抗氧化试验和抑菌试验筛选出PL、RE、TP 3 种具有良好抑菌抗氧化活性的生物保鲜剂，通过单因素试验确定各保鲜剂最佳添加量范围，利用响应面法确定复合生物保鲜剂的最佳添加量为聚赖氨酸盐酸盐添加量0.20 g/L、迷迭香提取物添加量0.23 g/L、茶多酚添加量0.20 g/L。对复合生物保鲜剂的作用效果进行测定，发现复合生物保鲜剂能在一定程度抑制小龙虾贮藏过程的氧化反应和微生物生长，在改善食品品质的同时，弥补了实际生产过程中单一保鲜剂保鲜效力不足的现状，对实际生产具有一定的指导意义。