金花葵中黄酮的提取及纯化研究进展

贾 娟，陈 品，王婷婷，李艳秋

（1.河南工业大学漯河工学院，河南 漯河 462002；2.漯河职业技术学院，河南 漯河 462002；3.合肥工业大学食品与生物工程学院，安徽 合肥 230601）

金花葵是一年生植物，隶属于锦葵科黄秋葵属，被称为“菜芙蓉”和“植物界的熊猫”[1]。《顺德府志》中记载金花葵在明朝就已经存在，2003 年中国农业科学研究院再次在河北邢台地区发现了金花葵。金花葵自然分布在河北地区，仿野生金花葵大量种植在河南、河北地区。金花葵喜欢温暖、阳光充足的地方，耐高热，耐严寒，对土壤的要求也不是很苛刻，因此除了在极寒地区不能很好地生长以外，在其他地区都可以种植。

金花葵的花无毒，具有祛湿热、消炎、镇痛的作用；果实和籽也是宝，具有保护脾胃、提高食欲和治疗跌打损伤等作用[2]。金花葵具有较高的药用价值，含有很多营养成分，如生育酚、多糖胶、微量元素、纤维素等。此外，金花葵含有较高的黄酮类化合物。随着国内外研究的不断深入，发现黄酮类化合物具有抗衰老、抗氧化、镇痛、抗突变、抑制肿瘤细胞等功能，越来越受到人们的重视和认可，这类化合物被广泛的应用于食品、药品、化妆品等行业[3-4]。因此，对黄酮类化合物的提取、纯化与应用已经成为医药、食品、生物工程等领域的重要课题。本文就近10 年来国内外学者对黄酮类化合物的提取分离纯化方法进行综述，旨在为合理开发利用金花葵资源，为黄酮类产品的开发提供一定的理论参考依据。

1 金花葵黄酮提取方法

1.1 超声波辅助提取法

超声辅助提取主要利用空化效应来破坏植物细胞，使溶剂渗透到植物细胞中，从而在短时间内把黄酮类化合物提取出来，提取时间短，温度低，杂质少，适用范围广[4-5]。宋琳琳等[5]利用超声波辅助提取工艺提取金花葵黄酮，最佳提取条件为乙醇浓度80%、液料比25∶1、提取时间35 min，提取率为8.47%。申利英等[6]利用响应面法对超声波辅助提取金花葵中黄酮进行了研究，在提取温度31.97 ℃、乙醇浓度50.56%、料液比1∶21.22、提取时间31.92 min 的条件下，得到金花葵中黄酮的提取率为50.52%。周宇涵等[7]采用响应面法优化超声提取金花葵总黄酮，最佳工艺为乙醇浓度75%，浸泡时间2.1 h，颗粒大小为45 目，总黄酮提取率的预测值为18.64%，实测平均值为18.03%。贾娟等[8]采用超声波提取法提取金花葵茎部黄酮，最佳提取工艺为液料比为30∶1（mL/g），乙醇浓度40%，时间20 min，pH5.0，提取1 次，此条件下粗黄酮得率为1.15%。超声波提取法是提取金花葵黄酮最常用的方法，主要原因是超声波提取法作为一种较为温和的提取方法对目标化合物成分的影响较小；同时，采用不同的条件提取黄酮，对黄酮类化合物提取率的影响也大不相同，由此可见，超声波对黄酮类化合物的提取仍有较大优化空间。

1.2 微波辅助提取法

微波辅助萃取是使用微波技术来进行萃取，微波辅助主要使用其热效应。因为含有水和极性有效成分的植物细胞在微波场中吸收了大量的热量，因而产生内部热效应使提取物的细胞结构分解，细胞外的溶剂很容易进入细胞内部溶解和释放胞内物质。微波辅助提取具有快速高效、加热均匀和操作简单的特点，是常用的提取手段的一种[9-10]。Qiu[11]采用微波辅助法提取金花葵花中黄酮，最佳工艺为乙醇浓度70%、提取时间30 s、微波功率360 W、料液比1∶50、颗粒度小于80 目，此时黄酮提取率为5.673%。提取温度和提取时间是微波提取法相对重要的因素，在剧烈的物理因素作用下，提取时间的微小差异都会影响实验结果；微波提取效果和等效扩散系数直接联系，因此对于不同物质状态的原料要选用合适的料液比，以得到相对最优的等效扩散系数。

1.3 索氏提取法

金花葵花中黄酮用索氏提取法进行提取效果也较好。索氏提取器最初被用来提取牛奶中的脂类化合物，后来多被用来提取植物中的黄酮，主要运用溶剂回流和虹吸原理进行萃取。索氏提取法具有较好的选择性、能耗低、操作简单等优点，但是相比较微波提取和超声波提取，需要较长的提取时间[12-13]。张路等[14]用索氏提取法提取金花葵的根中的总黄酮，通过正交试验进行工艺优化，得出最佳提取工艺条件为乙醇浓度60%，料液比1∶35，在80 ℃的温度下提取3 h，在此条件下黄酮的提取率可达到4.55%。索氏提取法的最大缺点是耗时较长，且对于不同形态结构的样品，提取条件不同，提取效果差异也会较大。

1.4 超高压提取法

超高压提取技术是一种先进的提取技术，常温下将100～1 000 MPa 的流体静压力作用于反应体系，使植物细胞内外产生较大的压差，细胞壁发生破裂，使细胞中的物质得到充分释放，从而促进物质转移至提取溶剂中的方法，由于提取温度低、提取时间短，故对有效成分破坏小，此方法具有健康、环保等优点，近年来，在植物活性成分的提取方面得到应用[15]。王雪竹等[16]通过响应面法优化金花葵总黄酮超高压提取的工艺条件，得出在压力400 MPa、提取时间4.5 min、乙醇浓度80%的条件下，总黄酮得率达到145.32 mg/g。佘迪等[17]通过响应面法优化超高压提取金花葵根部黄酮的工艺条件，在压力400 MPa、保压时间8.3 min、乙醇体积分数70%优化条件下，黄酮得率为（3.87±0.13）%。与其他提取技术相比，超高压提取技术有无可比拟的优势，由于可在常温下进行操作，对热不稳定的提取物有一定的保护作用，得率相对较高。此外，超高压提取不产生废料，符合绿色环保的趋势，具有十分广阔的应用前景。

2 金花葵黄酮纯化方法

2.1 大孔吸附树脂法

大孔树脂是一种有机高聚物吸附剂且具有很好的吸附功能和稳定性，对不同物质的吸附性与树脂的极性有关，利用这一特点可以有效地将所需的有效成分提取出来。大孔树脂吸附工艺是分离纯化黄酮类化合物最常用的一种方法，稳定性、选择性好[18-19]。王蕾等[20]为研究分离纯化金花葵茎叶中总黄酮的最佳条件，选择LX-J 系列、DM130、D101、AB-8 等10 种大孔树脂，以金花葵茎叶中总黄酮的含量为参考指标，筛选出其中最优树脂，通过试验得到了最佳纯化条件，即样液浓度3 mg/mL，pH值5.0，吸附流速3 BV/h，过柱次数3 次，70%乙醇的洗脱速率4 BV/h 的条件下，LX-J24 大孔树脂对总黄酮的吸附与解吸效果均为最佳，金花葵茎叶中总黄酮的含量提取率为78.06%，纯度高达57%。张月琴[21]利用AB-8 大孔树脂对金花葵总黄酮提取物进行纯化，去除水溶性杂质,金花葵黄酮含量增高,洗脱液真空浓缩后,经冷冻干燥后得到黄棕色粉末。

2.2 膜分离法

膜分离法是选择具有分离功能的天然或合成的膜材料作为分离介质，在浓度差、压力差或电位差等作用下，将不同分子量区段组分分离、纯化、浓缩的新型分离技术。这种方法可以在常温下进行，保护有效成分、样本量大、操作简单、能耗低、广泛的应用在医药和食品工业中[22]。目前膜分离技术在金花葵的分离纯化上未见报道，但随着膜分离技术的发展，分离纯化的特点明显，优势显著，膜分离技术越来越受到大家的重视，尤其在植物的分离纯化中应用前景好，金花葵黄酮的分离纯化可以参照其在其他物质上的应用，如滕春丽[23]利用HPS-100 超滤膜分离技术对红托竹荪多糖进行分离纯化，将多糖含量提升至71.73%。罗爱勤等[24]采用膜分离法制备灵芝孢子多糖得率高于醇沉法，为（4.61±0.28）%；LI 等[25]采用截留不同相对分子质量的2 个纳滤膜，从大豆发酵液中分离纯化低聚糖，得率83.2%，多糖含量77.9%。Cai 等[26]将微滤、超滤、纳滤膜集成膜分离系统，从猴头菌中分离粗寡糖，得率14.8%，寡糖含量63.7%。

2.3 高速逆流色谱技术

高速逆流色谱技术又称为离心分配色谱、液-液分配色谱，是一种两互不相溶的液体体系分别作为固定相和流动相，进行续有效液液分离，溶质在两相中分配分离的色谱技术。这种分离提纯技术为可逆吸附、样品损失小、提高了回收率、分离速度快、降低成本等特点，在生物制药、活性成分分离等方面具有较大应用价值[27-29]。目前高速逆流色谱技术在金花葵的分离提纯上未见报道，但因其提纯物纯净、制备量大、技术成本低等优点，正在发展成为一种备受关注的新型液液分配色谱分离纯化技术，广泛应用于天然药物有效成分的分离，制备金花葵黄酮的分离纯化可以参考其他的物质上的应用，如姜姣姣等[30]以石油醚-乙酸乙酯-甲醇-水（5∶5∶3∶7，V/V/V/V）为溶剂系统，采用高速逆流色谱技术对藜芦中的甾体类生物碱进行分离鉴定，藜芦酰棋盘花胺和介芬胺的纯度分别为91.34%、98.10%。尹雪莲[31]以正己烷-甲醇-水（14∶7∶0.06，V/V/V）分离体系，采用高速逆流色谱法对乙酯型鳀鱼油进行分离提纯棕榈油酸，含量为70.57%，纯度可达（94.89±0.68）%。宋道光等[32]以正己烷/正丁醇/水/冰乙酸（系统I：1∶2∶1∶0.1，V/V/V 和系统II：1∶1∶1∶0.1，V/V/V/V）为溶剂系统，从小叶金钱草中分离四种黄酮苷类化合物,其纯度均大于95%。吴雪[33]采用30%磷酸二氢钠-乙醇-丙酮（6∶2∶1.5，V/V/V）为溶剂体系，通过高速逆流色谱法，分离麦芽糖基-β-环糊精，并鉴定其纯度，其最高纯度为93.2%。

3 金花葵黄酮测定方法

3.1 分光光度法

分光光度法经常被用来测定样品中的黄酮含量，它需要在一定的波长范围中测定吸光度，方法简便，灵敏度高。使用分光光度法测定黄酮含量时，需要先确定黄酮的吸收波长，然后在这个波长下使用分光光度计来得到样品的吸光值，使用芦丁作为标准品得到回归方程，然后根据回归方程计算出黄酮含量。分光光度法操作简单，但是速度快，准确度相对不高。曹东怡等[34]利用分光光度法在508 nm 下测定不同部位金花葵黄酮含量，其中花中总黄酮含量最高，达22 299.62 μg/g，其余部位（种子、果皮、茎、根）总黄酮含量均低于4 000.00 μg/g。张晓娇等[35]利用分光光度计法（测定波长510 nm）对金花葵花冠中黄酮含量进行了测定，其黄酮含量为（43.23±0.56）mg/g。

3.2 高效液相色谱法

高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在完成各成分的分离之后，进入检测器检测的方法，分析速度快，一般情况下15～30 min就可以分析一个样品，适用范围广，且对于热稳定性比较差的化合物的分析也有一定的优势。吴正超等[36]利用高效液相色谱法对金花葵中黄酮类物质进行了定量分析，得到平均加标回收率为95.20%～109.48%，RSD 小于2.24%，表明该方法检测准确且精密度较好，可实现金花葵花黄酮类成分快速鉴定，为其药效物质基础及质量控制研究提供依据。高效液相色谱法效率高、灵敏度高，但是分析成本高。在进行黄酮含量测定时，可以根据实际情况选择测定方法。

4 展望

金花葵中含有大量的黄酮类化合物，具有较高的营养和开发价值。对提取及纯化金花葵中的黄酮进行研究，有利于更好地利用金花葵资源，服务地方经济。黄酮的提取工艺还有很多，如酶辅助提取技术、超临界萃取技术。酶辅助提取技术是一种利用酶来提取物质的一种工艺，酶可以有效地分解植物组织并保留提取物中的有效成分，因此可以用酶来辅助提取。酶辅助提取法可以软化植物细胞壁使有效成分流出，从而提升提取率，通常可以使用纤维素酶、果胶酶等酶来进行提取，这种工艺很适合用来提取植物中的成分；同时，酶辅助提取工艺不仅操作简便而且比较环保，是提取工艺的研究热点[37]。使用酶辅助提取工艺提取金花葵中黄酮的研究还比较少，这种方法目前多被应用在其它天然植物活性成分的提取上，它的提取效果也很好，可以使用这种方法来提取金花葵中黄酮。超临界萃取技术以超临界流体为萃取剂，把萃取物从混合物中分离出来，具有安全性高、萃取速度快能耗低等特点。高压脉冲电场技术通过使用高压脉冲电场对样品进行处理，来增加细胞质膜的通透性而造成细胞内的物质流出，可以用来提取黄酮[38]。将两种提取工艺相结合会得到更好的提取效果。

金花葵浑身都是宝，金花葵类产品在市场上具有很大的发展前景，市场上对金花葵相关产品的需求也很大。同时，对金花葵中黄酮提取和纯化的进一步研究也刻不容缓，优化金花葵中黄酮的提取工艺、增强金花葵中黄酮的提取效果，可以最大程度利用金花葵资源，这不仅对提取纯化黄酮的研究具有极大的意义，而且能更好的为地方经济服务。