春季池塘养殖病害综合防治技术

杨 娟，丁丰源，康鹏天，王秀琴，张国维

(甘肃省渔业技术推广总站，甘肃 兰州 730030)

入春以来，甘肃地区一养殖池塘鱼病害频发，损失严重，笔者通过病样采集、细菌分离鉴定及药敏试验，科学指导了养殖生产过程中的细菌病防治。

一、细菌分离鉴定及药敏试验

1.主要症状 鳃部充血、鳍条出血、皮肤溃疡、鳞片脱落、黏液增多，解剖可见腹水、内脏出血、水肿等症状，初步诊断为细菌性感染。

2.样品处理 将病鱼在无菌环境下剖解，取内脏置于无菌平皿中，用灭菌剪刀剪取其横断面，制备菌液。

3.药敏试验 将菌液取100微升涂板，贴药敏纸片，18℃下培养20 小时，测定抑菌圈直径，参照NCCLS 的判断标准进行结果判定，显示头孢他啶、头孢噻肟、头孢哌酮、阿米卡星和左氟沙星抑菌效果最佳。

4.细菌分离纯化 在普通营养琼脂平板划线接种，18℃培养24 小时，观察平板细菌生长情况，根据菌落的形态特点，挑取多个典型单菌落，涂片，镜检。如此反复，直到纯化为单一菌落。

5.16S rRNA 序列分析 根据TIANamp Bacteria DNA Kit 试剂盒说明书提取分离菌株的基因组DNA。

根据平板上菌落的颜色、形态、大小等特征挑取不同菌落于含LB 液体培养基的试管中(共12 管)，18℃过夜培养，第2 天依据细菌DNA 提取试剂盒的操作流程分别提取12株细菌的DNA，并进行PCR 扩增。反应体系：Premix Taq™(Ex Taq™Version 2.0 plus dye)12.5 微升，DNA 模板1 微升，上、下游引物各1 微升，dd 水补足至25 微升。反应条件：95℃预变性3 分钟，95℃变性30 秒，退火55～65℃，延伸90 秒，Cycle 39×，再延伸5 分钟，4℃下保存。用1.5%琼脂糖凝胶电泳并查看结果。

将PCR 产物条带切割，放入1.5 毫升离心管中，根据胶回收试剂盒的操作流程分别对12 株菌落进行胶回收。最终将PCR胶回收产物再次用琼脂糖凝胶验证后送金唯智公司进行16S rRNA测序。

图1 纯化后的PCR扩增产物

金唯智公司测序返回的12 株细菌序列分别进行拼接并在NCBI中比对，结果见表1。

表1 菌株16S rRNA 序列分析

通过对病鱼主要组织和内脏器官进行初步诊断及病原菌分离、16S rRNA 扩增和测序，检测到假单胞菌、腐败希瓦氏菌、温和气单胞菌、紫色杆菌等多种病原菌，并通过药敏试验，筛选出氯霉素、复方新诺明等敏感药物，为科学指导养殖生产过程中的细菌病防治提供了一定依据。

二、春季鱼病害综合防治措施

1.彻底清塘消毒，杀灭病原菌 干塘后清除杂草和池底淤泥，修整并加固塘埂。经修整过的池塘暴晒15～20 天，然后用150～200 千克/亩的生石灰溶液全池泼洒，随即均匀翻耙底泥。排水困难的鱼塘，可带水清塘，水深为0.8～1 米时，用120～150千克/亩的生石灰溶液全池泼洒。生石灰除可杀灭野杂鱼和病原菌外，还能改良底质、中和酸性、提高pH、释放营养素，保证有机物质的良性循环，同时还能补充塘鱼发育生长所需的钙质。

2.抓水质管理，保持水环境稳定 春季气温较低时，养殖池塘通常将水位调节为50～60 厘米，这样有利于水温的升高。在水体温度达到10℃以上时开始加注新鲜水，加水应坚持少量多次的原则，以防水温骤降，同时应适当施有机肥，以利提高水温。遇连续阴雨天气时，气压较低，水体易缺氧，要适当增加水深，以防水温变化幅度过大，减少鱼应激。

3.提早开食，科学投喂 当池塘水温上升到10℃以上时，一般的水产养殖动物已开始摄食，摄食量随水温的升高而逐渐增大，应及早开食，投喂新鲜质优的饲料，促进鱼体质的恢复。此时需隔天投饵1次，投饵量为鱼体重的1%左右；当池塘水温达到15℃以上时，开始正常投喂，每天上午9:00—10:00、下午3:00—4:00各投饵1次，投饵量为塘鱼体重的3%～5%。投饲时必须严格遵循“四定和四看”原则，即：定时、定位、定质、定量和看天气、看水质、看季节、看吃食情况。

4.加强越冬管理 一是越冬前强化培育。在越冬之前要多投喂一些富含蛋白质、脂肪的饲料，提高越冬鱼肥满度，使其能够顺利越冬。二是防止鱼体冻伤。在冬季适当提高水位，保持相对稳定的水温，防止鱼体冻伤，有利于增强鱼体抗寒能力和抗应激能力。三是规范操作，防止鱼体机械损伤。冬季拉网、并塘、转塘、运输过程中，要规范操作，防止鱼体受伤。

5.准确诊断，科学用药 根据细菌分离鉴定及药敏试验结果，可选用头孢他啶、头孢噻肟、头孢哌酮、阿米卡星和左氟沙星等抗生素类药物进行对症治疗。