菊花中216种农药残留检测分析△

李海亮，刘芫汐，王赵，昝珂，王莹，金红宇，马双成

中国食品药品检定研究院，北京 102629

菊花为菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥头状花序，具有平肝明目、清热解毒等功效，常用于风热感冒、疮痈肿毒、头痛眩晕、眼目昏花、目赤肿痛等[1]，含有黄酮、氨基酸、绿原酸、挥发油及微量元素等类成分，具有抗菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等功效[2-5]。菊花在我国药用和栽培历史悠久，《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版（一部）规定，菊花按产地和加工方法的不同，分为滁菊、亳菊、杭菊、贡菊和怀菊[1]。菊花种植区主要分布于安徽、浙江、河南、江苏等省，其中安徽黄山、浙江桐乡、江苏射阳、河南焦作等地种植较多；其种植过程中滥用农药问题较为严重，农药残留风险较大，严重影响菊花的质量和用药安全[6]。因此，有必要对菊花中的农药残留进行监测，进一步开展菊花中农药残留的风险评估，为制定合理的菊花农药残留标准限度提供科学依据。

在种植过程中，菊花常受多种病虫害的影响，主要病害有叶斑病、叶枯病、灰霉病、病毒病、斑枯病、根腐病、白粉病等，主要虫害有蚜虫、斜纹夜蛾、菊潜叶蝇等，种植过程中主要使用有机氯、有机磷、拟除虫菊酯等类农药[7-8]。除禁用农药残留外，多菌灵、噻虫嗪、啶虫脒、烯酰吗啉、戊唑醇、百克敏等为菊花中检出率较高的农药品种[6]。目前，已有学者建立了菊花中有机氯类、有机磷类、禁用类等农药的测定方法[9-15]。本课题组通过调查研究结合查阅现行国家农药名录，筛选出216 种常用农药作为检测指标，借鉴本课题组前期对花类、果实类等中药中禁用、常用农药的检测方法[16-18]，将样品经乙腈高速匀浆提取后浓缩，采用液相色谱-质谱法（LC-MS/MS）和气相色谱-质谱法（GC-MS/MS）进行检测。

1 材料

1.1 样品

菊花样品分别来自浙江（39 批）、安徽（23批）、江苏（8批）、河南（3批）、河北（5批）的饮片厂、药店、种植基地、个体农户等，具有较好的代表性。样品经中国食品药品检定研究院王莹副研究员鉴定为菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥头状花序。

1.2 仪器

QP2040 型气相色谱串联质谱仪、LCMS-8060NX 型液相色谱串联质谱仪、LC-40DXS 型液相色谱均购于日本岛津公司；FA1004C FA/JA-C 型电子分析天平（上海越平科学仪器有限公司）；AH30型高速全自动匀浆仪（睿科仪器有限公司）；Z260A型离心机（德国Hermble 公司）；Hel-VAP Advantage ML/HB型旋转蒸发仪（德国Heidolph 公司）。

1.3 试药

乙腈（色谱纯，Thermo Fisher 公司）；其他试剂均为分析纯；水为蒸馏水；农药对照品来源于中国计量科学院、中国食品药品检定研究院、Ehrenstorfer 公司，以乙腈为溶剂配制成质量浓度为100 μg·mL-1的单标储备溶液，-20 ℃密封避光保存备用。

2 方法与结果

2.1 测定条件

2.1.1 GC-MS/MS 分析条件 DM-17ms 毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；载气为高纯氦气；柱流速为1.0 mL·min-1；恒流模式，进样口温度为240 ℃；不分流进样；升温程序（初始温度为60 ℃，保持1 min，以30 ℃·min-1升至120 ℃，以10 ℃·min-1升至160 ℃，以2 ℃·min-1升至230 ℃，以15 ℃·min-1升 至300 ℃，保 持6 min，以20 ℃·min-1升 至320 ℃，保持3 min）；离子源温度为200 ℃；离子源为电子轰击源（EI）；EI 能量为70 eV；碰撞气为氩气；质谱传输接口温度为250 ℃；采用多反应监测（MRM）模式。各农药参考保留时间（tR）、监测离子对、碰撞电压（CE）等信息见表1。为提高分析指标的检测灵敏度，根据tR进行分段监测分析。

2.1.2 LC-MS/MS 分析条件 UPLC C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.6 μm）；流动相A为0.1%甲酸水溶液（含5 mmol·L-1甲酸铵），流动相B为95%乙腈水溶液（含5 mmol·L-1甲酸铵、0.1%甲酸），梯度洗脱（0～10 min，80%～5%A；10～12 min，5%A；12～13 min，5%～80%A；13～16 min，80%A）；柱温为40 ℃，流速为0.3 mL·min-1，进样量2 μL。以三重四极杆串联质谱仪检测，电喷雾离子源（ESI），采用MRM 模式；毛细管电压为2.5 kV，去溶剂温度为550 ℃，离子源温度为150 ℃；去溶剂气体积流量为900 L·h-1，锥孔气体体积流量为150 L·h-1，碰撞气压为48 kPa。各化合物参考tR、锥孔电压、监测离子对见表2。为提高分析指标的检测灵敏度，根据tR进行分段监测分析。

表2 LC-MS/MS测定农药的tR、质谱参数

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 分别精密称取表1、表2 中农药对照品5 mg 置50 mL 量瓶中，加乙腈溶解，稀释至刻度，作为对照品储备溶液，存放于-20 ℃冰箱中避光密封保存。分别精密量取表1、表2 中各农药对照品储备液1～3 mL，置200 mL 量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，分别作为GC-MS/MS和LC-MS/MS测定用混合对照品溶液。

2.2.2 内标溶液的制备 精密称取磷酸三苯酯，加乙腈溶解，制成内标储备溶液（100 μg·mL-1），精密量取内标储备液适量，加乙腈稀释，配制成内标溶液（0.1 μg·mL-1）。

2.2.3 供试品溶液的制备 将供试品粉碎过三号筛，精密称取粉末约5 g，加乙腈50 mL，加氯化钠1 g，12 000 r·min-1匀浆处理3 min后，5000 r·min-1离心5 min（离心半径为10 cm，下同），取上清液，沉淀加入乙腈50 mL，匀浆处理2 min，再次5000 r·min-1离心5 min，合并2 次上清液，40 ℃减压浓缩至3～5 mL，定容至25 mL 量瓶中，摇匀，采用微孔滤膜滤过，即得。

2.2.4 空白基质溶液的制备 精密称定空白样品粉末约5 g，置100 mL试管中，按2.2.3项下方法制备空白基质溶液。

2.2.5 基质混合对照品溶液的制备 精密量取混合对照品储备溶液适量，加入空白基质溶液，制成对照品质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100 ng·mL-1的基质混合对照品溶液。

2.3 样品测定

2.3.1 GC-MS/MS 测定 分别精密量取各系列质量浓度混合对照品溶液及供试品溶液1.0 mL，精密加入内标溶液0.3 mL，混匀，微孔滤膜滤过，精密吸取1 μL 注入气相色谱串联质谱仪进行测定，采用内标标准曲线法计算供试品溶液中农药的残留量。GC-MS/MS 测定空白基质匹配的混合对照品总离子流图（图1）。

图1 GC-MS/MS测定菊花空白基质匹配的对照品总离子流图

2.3.2 LC-MS/MS 测定 分别精密量取各系列质量浓度混合对照品溶液及供试品溶液1.0 mL，精密加水0.3 mL，混匀，微孔滤膜滤过，精密吸取2 μL注入液相色谱串联质谱仪测定，采用外标标准曲线法计算供试品溶液中农药的残留量。LC-MS/MS 测定空白基质匹配的混合对照品总离子流图（图2）。

图2 LC-MS/MS测定菊花空白基质匹配的对照品总离子流图

2.4 方法学验证

2.4.1 专属性考察 对质谱条件进行优化调整，同时考虑到基质特点与响应值，选择适合的MRM 离子对，使其适应菊花中的农药多残留检测。实验结果表明，菊花空白样品基质对农药残留的干扰较小，表明方法专属性较好。

2.4.2 定量限 取混合对照品溶液，使用乙腈进行逐级稀释，按2.3 项下方法进行测定，以相关定量离子信噪比（S/N）为3∶1 时的质量浓度作为检测限（LOD）。LOD结果见表3、表4。

表3 GC-MS/MS测定82种农药的线性方程、r、LOD、回收率及精密度

表4 LC-MS/MS测定134种农药的线性方程、r、LOD、回收率及精密度

2.4.3 标准曲线 取空白基质匹配的不同质量浓度混合对照品溶液，注入仪器进行测定，以质量浓度作为横坐标（X）、峰面积作为纵坐标（Y），绘制标准曲线。实验结果表明，216 种农药的r为0.960～0.999，其中90%的农药r＞0.995，表明方法线性关系良好，结果见表3、表4。

2.4.4 精密度试验 取同一份供试品溶液，连续进样6 次，各待测峰面积RSD 均小于10.0%，符合痕量多残留分析技术要求，结果见表3、表4。

2.4.5 加样回收率试验 取菊花空白样品粉末约5 g，分别加入10、50、100 μg·kg-13 个水平的混合对照品，每个水平重复3 次，按2.2.3 项下方法制备供试品溶液并按2.3 项下方法测定，测得结果使用随性标注曲线进行计算。结果表明，各待测指标3 个水平的加样回收率均为70%～115%，RSD均小于10.0%，实验结果符合残留痕量分析要求，结果见表3、表4。

2.5 测定结果

对78 批菊花中的216 种农药进行了筛查，其中68个农药有检出（表5）。

表5 菊花中农药残留检出情况

3 讨论

3.1 农药参数的选择

本研究在进行检测指标的选择时，选取了对菊花样品监测具有重要意义的216 种农药进行GC-MS/MS和LC-MS/MS检测分析。本研究选择检测指标的依据：1）我国除《中国药典》2020 年版规定的33种禁限用农药外的禁限用农药，包括部分农药有毒理学意义的代谢产物；2）登记过的菊花种植中可使用的农药，如井冈霉素A、吡虫啉、啶虫脒、吡唑醚菌酯等；3）菊花种植过程中实际使用的农药，如戊唑醇、丙溴磷、多菌灵、霜霉威、腐霉利、吡唑醚菌酯、烯酰吗啉等；4）我国农业生产中部分常用的农药；5）适合采用GC-MS/MS 或LC-MS/MS 测定的农药。

3.2 样品前处理方法的选择

农药残留分析中常用的提取溶剂有丙酮、乙酸乙酯和乙腈等，丙酮与水互溶且易提取出色素等杂质，乙酸乙酯对极性大的农药回收率偏低，乙腈可提取极性范围较宽的多种农药残留，可避免大多数亲脂性杂质的干扰。本研究参考《中国药典》2020年版（四部）中2341 农药残留量测定法（第五法）［19］，选择乙腈为提取溶剂，对菊花的前处理方法进行了考察和优化，包括乙腈高速匀浆直接提取法、快速样品处理法（QuEChERS）、直接提取法提取后通过亲水亲脂固相萃取（HLB）柱净化3 种方法。从回收率结果来看，3 种方法回收率均为70%～120%，符合要求。本研究采用直接提取法基本可满足分析要求，此法操作简便、成本低，提高了农药分析的效率。

3.3 农药多残留测定结果分析

菊花种植过程中病虫害较多，规模化种植过程中多使用农药，因此本研究检出的农药种类较多，且所有批次样品中均有农残检出，检出农药数最多的一批样品检出农药38 种，平均每批菊花检出农药11 种。在本研究选择的农药指标中，吡唑醚菌酯、吡虫啉、吡蚜酮、啶虫脒、噻虫嗪和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐已登记用于菊花，为可以使用的农药，其他农药未登记。检出率超过20%的农药为吡唑醚菌酯、啶虫脒、多菌灵、戊唑醇、虫螨腈、噻虫嗪、吡虫啉、茚虫威、烯酰吗啉、丙溴磷、甲氧虫酰肼、苯醚甲环唑、霜霉威盐酸盐、氯氰菊酯、丙环唑、哒螨灵，其中检出率超过50%的农药为吡唑醚菌酯、啶虫脒、多菌灵、戊唑醇、虫螨腈、噻虫嗪，检出农药均为菊花实际种植中可能使用的农药。虽然，菊花中农药残留检出率较高、检出品种较多，但多为中低毒性农药。

本研究建立了菊花中216 种常用农药残留的快速检测方法，经过验证，方法简便快捷、灵敏度高、选择性好，适用于菊花农药多残留的快速筛查分析，对菊花中农药残留监测有一定参考价值。所检测的农药残留数据为进一步风险评估提供了基础数据。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。