麻杏石甘汤对咳嗽变异型哮喘大鼠IL-6/STAT3信号通路及TRPV1感受器的影响

杨倩， 江波， 孙勤国， 吕琨， 罗蒙， 黄天慧

（武汉市第三医院中医科，湖北武汉 430000）

咳嗽变异型哮喘（cough variant asthma，CVA）是以慢性咳嗽为主要或唯一临床表现的一类特殊型哮喘，多因反复暴露于特定过敏原引起。CVA具有病程长、易反复的特点，抗生素、祛痰药、黏液溶解药、镇咳药或β-肾上腺素能激动剂等均对其无治疗效果[1-2]。CVA 的发病机制及病理生理与典型哮喘相似，均以持续气道炎症、气道高反应性和气道重构为特点[3]。既往体内外研究证明，麻杏石甘汤及其拆解处方在改善哮喘气道高反应性、抗过敏和抗炎方面都具有显著疗效[4]。本课题组前期临床研究也发现，麻杏石甘汤对大鼠哮喘有缓解作用，但其具体作用机制尚不清楚。白细胞介素6（IL-6）是重要的促炎因子，可与细胞膜上的gp130 相互作用，使信号转导和转录激活子3（STAT3）发生磷酸化，产生多种生物效应，与哮喘气道炎症密切相关[5]。瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV1）作为一种伤害性感受器，几乎遍布整个呼吸系统，通过感知各种外源性或内源性的刺激，既能促进哮喘的一系列病理过程，又能限制哮喘的炎症和免疫反应[6]。因此，本研究构建CVA大鼠模型，观察麻杏石甘汤对IL-6/STAT3 信号通路及TRPV1 感受器的影响，探讨其对CVA 的治疗作用及机制，以期为临床应用提供参考，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 60只4周龄雄性SD大鼠，体质量90~110 g，购自湖北贝恩特生物科技有限公司，实验动物生产许可证：SCXK（鄂）20210027。饲养环境为SPF级动物房，大鼠自由饮食、活动，所有实验操作符合实验室规定，本研究通过武汉市第三医院动物伦理委员会批准（批号：2022-05-160）。

1.2 药物、试剂与仪器 麻杏石甘汤处方组成：麻黄9 g，杏仁9 g，生石膏18 g，炙甘草6 g，由武汉市第三医院院内煎制，浓缩至全方生药量2 g/mL。STAT3 激活剂Colivelin（Col，美国MCE 公司，批号：HY-P1061）；卵清蛋白（美国Sigma公司）；单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒（上海酶联生物公司）；IL-6、STAT3、TRPV1等一抗（美国Abcam公司）。肺功能分析系统（北京贝兰博科技有限公司）；呼吸机（寰熙医疗公司）；诱咳引喘仪（上海玉研科学仪器有限公司）。

1.3 分组、造模与给药 将60只大鼠随机分为正常组，模型组，麻杏石甘汤低、高剂量组，麻杏石甘汤高剂量+Col 组，每组12 只。除正常组外，其他各组大鼠构建CVA模型[7]。造模方法：给予大鼠隔天腹腔注射1 mL 增敏剂（含1 mg 卵清蛋白和10 mg氢氧化铝），共注射7次后，将大鼠放入点燃艾条的烟熏柜中2 h，每日2 次，持续40 d。造模结束后，大鼠表现出毛发干燥，活动减少，出现呼吸急促、打喷嚏、喘息、烦躁不安等哮喘发作相关症状，则说明模型建立成功。根据《中国药理实验方法学》[8]公式，使用成人剂量换算大鼠等效用药量，麻杏石甘汤低、高剂量组大鼠分别灌胃3.5、7.0 g·kg-1·d-1的麻杏石甘汤；麻杏石甘汤高剂量+Col组大鼠灌胃麻杏石甘汤7.0 g·kg-1·d-1，腹腔注射Col 0.5 mg·kg-1·d-1[9]；正常组和模型组大鼠灌胃等体积生理盐水。每日1次，连续给药7 d。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 体征观察 给药结束后，观察和对比各组大鼠皮毛、活动、哮喘、呼吸等一般体征的变化。

1.4.2 咳嗽次数观察 给药结束后，将大鼠置于诱咳引喘仪雾化盒中使之吸入辣椒素雾化剂（1×10-4mol/L）[10]，持续时间60 s，停止刺激，记录各组大鼠2 min内的咳嗽次数。

1.4.3 气道阻力（RE）检测 大鼠禁食12 h后，使用戊巴比妥钠麻醉大鼠，切开气管进行气管插管并连接肺功能分析系统和呼吸机。静脉注射生理盐水后立即记录RE 作为基础值，每隔5 min 依次静脉注射0.025、0.05、0.1 mg/kg 的乙酰胆碱，测定RE。

1. 4. 4 EOS 计数 麻醉大鼠，结扎右侧主支气管，经气管插管，使用预冷的Hanks液灌洗支气管肺泡6 次，每次0.5 mL。回收支气管肺泡灌洗液，离心后取沉淀，经生理盐水重悬，取10 μL细胞悬液涂片。Diff-Quik染色涂片后进行EOS计数。

1.4.5 苏木素-伊红（HE）染色法观察肺、支气管组织病理学特征 处死大鼠后，取右肺组织和支气管组织，生理盐水冲洗，将组织浸泡于4%多聚甲醛溶液固定，制作石蜡切片。苏木素-伊红（HE）染色后在显微镜下观察组织的病理学特征。

1. 4. 6 ELISA 法测定肺组织MCP-1、TNF-α含量 取肺组织，剪碎，匀浆，于4 ℃离心20 min，取上清。按照ELISA 试剂盒操作要求检测上清样本中MCP-1、TNF-α的含量。

1.4 加工技术水平较高：红干辣椒分批采收，采收后自然风干，分户保管储藏。辣椒加工由原来简单的加工已发展到工厂加工。整个加工过程采用半自动化管理，只有在包装环节由专门人员来完成。这不仅使产品有了安全卫生保证，而且降低了生产成本。辣椒产品由原来只加工辣椒粉，现已开发出了辣椒丝、辣椒油、辣椒酱、辣椒粉等系列产品，出口南韩、香港、南非及东南亚。

1. 4. 7 Western Blot 法检测肺组织IL-6、STAT3、TRPV1 蛋白表达 取肺组织，匀浆，离心，取上清。定量上清蛋白浓度，在凝胶中上样，电泳，转膜。使用胎牛血清封闭PVDF膜，剪切样品目的条带孵育在IL-6、STAT3、TRPV1抗体稀释液（1∶1 000）中4 ℃过夜，室温下加入二抗孵育1 h，滴加发光液，显影。使用ImageJ 软件分析蛋白表达水平，结果以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值表示，内参为GAPDH。

1.5 统计方法 采用GraphPad Prism 8.0.2 软件进行数据分析，计量资料符合正态分布以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体征变化比较 正常组大鼠毛发光亮，饮食活动无异常，呼吸平稳，无异常咳嗽、喘息现象；模型组大鼠毛发干燥，活动减少，呼吸急促，打喷嚏，喘息，烦躁不安；相较于模型组，麻杏石甘汤低、高剂量组大鼠毛发光泽度增加，哮喘明显改善，呼吸较均匀；相较于麻杏石甘汤高剂量组，麻杏石甘汤高剂量+Col 组大鼠哮喘加重，其他体征与模型组类似。

2.2 各组大鼠咳嗽次数比较 表1 结果显示：与正常组比较，模型组大鼠咳嗽次数增加（P＜0.05）；与模型组比较，麻杏石甘汤低、高剂量组大鼠咳嗽次数呈剂量依赖性减少（P＜0.05）；与麻杏石甘汤高剂量组比较，麻杏石甘汤高剂量+Col组大鼠咳嗽次数增加（P＜0.05）。

表1 各组大鼠咳嗽次数比较Table 1 Comparison of cough frequency of rats among various groups（）

表1 各组大鼠咳嗽次数比较Table 1 Comparison of cough frequency of rats among various groups（）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与麻杏石甘汤低剂量组比较；④P＜0.05，与麻杏石甘汤高剂量组比较

咳嗽次数/次1.50±0.17 5.92±0.60①4.25±0.51②2.75±0.32②③5.33±0.57④185.603＜0.001组别正常组模型组麻杏石甘汤低剂量组麻杏石甘汤高剂量组麻杏石甘汤高剂量+Col组F值P值鼠数/只12 12 12 12 12

2.3 各组大鼠RE比较 表2结果显示：在0.025、0.05、0.1 mg/kg 等3种剂量乙酰胆碱的刺激下，与正常组比较，模型组RE升高（P＜0.05）；与模型组比较，麻杏石甘汤低、高剂量组大鼠RE剂量依赖性降低（P＜0.05）；与麻杏石甘汤高剂量组比较，麻杏石甘汤高剂量+Col组大鼠RE升高（P＜0.05）。

表2 各组大鼠气道阻力（RE）比较Table 2 Comparison of airway resistance（RE）of rats among various groups（）

表2 各组大鼠气道阻力（RE）比较Table 2 Comparison of airway resistance（RE）of rats among various groups（）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与麻杏石甘汤低剂量组比较；④P＜0.05，与麻杏石甘汤高剂量组比较

不同浓度乙酰胆碱刺激下RE/Pa 0.1 mg/kg 0.74±0.09 1.12±0.10①0.98±0.09②0.82±0.09②③1.06±0.11④33.212＜0.001组别正常组模型组麻杏石甘汤低剂量组麻杏石甘汤高剂量组麻杏石甘汤高剂量+Col组F值P值鼠数/只12 12 12 12 12 0.025 mg/kg 0.35±0.04 0.52±0.06①0.45±0.05②0.39±0.04②③0.48±0.05④23.750＜0.001 0.05 mg/kg 0.51±0.06 0.74±0.08①0.66±0.07②0.58±0.06②③0.70±0.09④19.443＜0.001

2.4 各组大鼠EOS 数目比较 表3 结果显示：与正常组比较，模型组EOS 数目升高（P＜0.05）；与模型组比较，麻杏石甘汤低、高剂量组大鼠EOS数目呈剂量依赖性降低（P＜0.05）；与麻杏石甘汤高剂量组比较，麻杏石甘汤高剂量+Col 组大鼠EOS数目升高（P＜0.05）。

表3 各组大鼠EOS数目比较Table 3 Comparison of EOS numbers among various groups of rats（）

表3 各组大鼠EOS数目比较Table 3 Comparison of EOS numbers among various groups of rats（）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与麻杏石甘汤低剂量组比较；④P＜0.05，与麻杏石甘汤高剂量组比较

EOS/（×106·个-1）0.12±0.02 3.80±0.41①2.36±0.34②1.66±0.18②③3.32±0.46④239.855＜0.001组别正常组模型组麻杏石甘汤低剂量组麻杏石甘汤高剂量组麻杏石甘汤高剂量+Col组F值P值鼠数/只12 12 12 12 12

2. 5 各组大鼠肺、支气管组织病理学特征比较 肺组织HE染色结果显示：正常组肺组织结构清晰完整；模型组肺组织炎性细胞浸润严重；与模型组比较，麻杏石甘汤低、高剂量组炎性细胞浸润显著减少；麻杏石甘汤高剂量+Col组肺组织损伤较麻杏石甘汤高剂量组严重。见图1。

图1 各组大鼠肺组织HE染色结果（×200）Figure 1 HE staining results of lung tissue of rats among various groups（×200）

支气管组织HE染色结果显示：正常组支气管纤毛排列整齐，未见炎性细胞浸润、细胞脱落迹象；模型组上皮细胞坏死、纤毛粘连甚至倒伏，黏液多；与模型组比较，麻杏石甘汤低、高剂量组上皮细胞损伤显著减轻，黏液分泌一定程度上减少；麻杏石甘汤高剂量+Col 组组织及细胞损伤严重，染色结果与模型组类似。见图2。

图2 各组大鼠支气管组织HE染色结果（×200）Figure 2 HE staining results of bronchial tissue of rats in each group（×200）

2. 6 各组大鼠肺组织MCP-1、TNF-α 含量比较 表4 结果显示：与正常组比较，模型组MCP-1、TNF-α 含量升高（P＜0.05）；与模型组比较，麻杏石甘汤低、高剂量组MCP-1、TNF-α 含量呈剂量依赖性降低（P＜0.05）；与麻杏石甘汤高剂量组比较，麻杏石甘汤高剂量+Col 组MCP-1、TNF-α含量升高（P＜0.05）。

表4 各组大鼠肺组织MCP-1、TNF-α含量比较Table 4 Comparison of MCP-1 and TNF-α contents in lung tissues of rats among various groups（，ng·mL-1）

表4 各组大鼠肺组织MCP-1、TNF-α含量比较Table 4 Comparison of MCP-1 and TNF-α contents in lung tissues of rats among various groups（，ng·mL-1）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与麻杏石甘汤低剂量组比较；④P＜0.05，与麻杏石甘汤高剂量组比较

TNF-α 1.23±0.15 4.57±0.52①3.48±0.50②2.12±0.25②③4.10±0.54④64.904＜0.001组别正常组模型组麻杏石甘汤低剂量组麻杏石甘汤高剂量组麻杏石甘汤高剂量+Col组F值P值鼠数/只12 12 12 12 12 MCP-1 4.67±0.53 12.17±1.44①8.92±1.03②6.39±0.71②③11.45±1.41④52.341＜0.001

2.7 各组大鼠肺组织IL-6、STAT3、TRPV1 蛋白表达比较 图3 和表5 结果显示：与正常组比较，模型组大鼠肺组织IL-6、STAT3、TRPV1 蛋白表达水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，麻杏石甘汤低、高剂量组大鼠肺组织IL-6、STAT3、TRPV1蛋白表达水平呈剂量依赖性降低（P＜0.05）；与麻杏石甘汤高剂量组比较，麻杏石甘汤高剂量+Col组大鼠肺组织IL-6、STAT3、TRPV1 蛋白表达水平升高（P＜0.05）。

图3 各组大鼠肺组织IL-6、STAT3、TRPV1的Western Blot条带Figure 3 Western Blot bands of IL-6，STAT3 and TRPV1 in lung tissue of rats in each group

表5 各组大鼠肺组织IL-6、STAT3、TRPV1蛋白表达比较Table 5 Comparison of protein expressions of IL-6，STAT3 and TRPV1 in lung tissue of rats among various groups（）

表5 各组大鼠肺组织IL-6、STAT3、TRPV1蛋白表达比较Table 5 Comparison of protein expressions of IL-6，STAT3 and TRPV1 in lung tissue of rats among various groups（）

注：①P＜0.05，与正常组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与麻杏石甘汤低剂量组比较

组别正常组模型组麻杏石甘汤低剂量组麻杏石甘汤高剂量组麻杏石甘汤高剂量+Col组F值P值TRPV1/GAPDH 0.34±0.05 0.75±0.08①0.60±0.07②0.39±0.05②0.71±0.07③27.674＜0.001鼠数/只6 6 6 6 6 IL-6/GAPDH 0.15±0.02 0.38±0.04①0.29±0.03②0.20±0.02②0.36±0.04③60.801＜0.001 STAT3/GAPDH 0.70±0.08 0.98±0.09①0.86±0.07②0.73±0.08②0.95±0.09③14.103＜0.001

3 讨论

咳嗽变异性哮喘（CVA）归属于中医学“久咳”“顽咳”“久嗽”等范畴，风、寒、热、瘀为主要病因，宿痰伏肺为主要病机，治疗应注重正邪盛衰，降气止咳，清热宣肺。麻杏石甘汤为解表剂，方中：麻黄宣肺解表平喘；石膏清肺胃热以生津；杏仁苦降肺气、止咳平喘，既助石膏沉降下行，又助麻黄泻肺热；炙甘草调和麻黄、石膏之寒温，保护胃气。共奏辛凉宣泄、清肺平喘之功。研究[11]证实，麻杏石甘汤有明显镇咳、祛痰功效，能够增强免疫反应、减轻炎症。本研究结果显示，麻杏石甘汤治疗后，CVA 大鼠毛发光泽度增加，呼吸平稳，咳嗽次数减少，说明麻杏石甘汤能够减轻CVA症状。

EOS是免疫反应和过敏反应过程中极为重要的细胞，其浸润到支气管上皮细胞会引起哮喘，促进EOS凋亡可以缓解哮喘气道炎性反应[12]。支气管对非特异性刺激反应过度收缩，会导致气道狭窄和RE增加，即气道高反应性（AHR）。AHR被认为是哮喘的关键特征之一，且与哮喘发病率正相关[13]。研究[14]发现，CVA 患者表现出气道功能障碍，RE 明显高于非CVA 人群。本研究结果显示，模型组大鼠RE 较正常组升高，EOS 上调，麻杏石甘汤组CVA 大鼠RE 值和EOS 较模型组显著降低，提示麻杏石甘汤具有改善CVA的功能。

哮喘是由多种细胞和炎症因子参与的气道慢性炎症性疾病[15]。MCP-1 和TNF-α 是免疫炎症反应的代表性细胞因子，减少MCP-1、TNF-α 的过多分泌可改善哮喘[16]。本研究发现，CVA大鼠肺组织炎性细胞浸润严重，支气管上皮细胞坏死、纤毛粘连甚至倒伏，黏液分泌较多，且肺组织MCP-1、TNF-α 含量增加，说明CVA 大鼠肺和支气管存在明显的炎症反应；麻杏石甘汤治疗后，CVA大鼠气道炎症反应和病理损伤明显减轻。

IL-6 是一种多效性促炎细胞因子，它的抑制/过表达与慢性炎症和多因素自身免疫性疾病有关[17]。STAT3是调节参与免疫反应的基因的核转录因子，决定了细胞如何整合接收到的环境信号，并最终将它们转化为特定基因组的转录调控[18]。核因子（NF）-κB 和STAT3 协同作用诱导NF-κB 过度激活，产生IL-6 等多种炎性细胞因子，因此非免疫细胞NF-κB 和STAT3 同时激活触发IL-6/STAT3轴，激活NF-κB 的正反馈回路，引发非免疫细胞和免疫细胞的相互作用，造成自身免疫疾病[16]。研究[19]发现，抑制IL-6/STAT3 信号通路显著减轻了卵清蛋白诱导的CVA 小鼠的严重程度。本研究结果显示，模型组大鼠肺组织IL-6、STAT3 蛋白表达水平较正常组升高，麻杏石甘汤组IL-6、STAT3蛋白表达水平较模型组显著下降，表明麻杏石甘汤对CVA 大鼠的治疗作用可能与抑制IL-6/STAT3信号通路有关。Col是IL-6/STAT3通路的激活剂，本研究另设置了麻杏石甘汤与Col联合处理组，相较于麻杏石甘汤单独处理组，CVA 大鼠肺及支气管病理损伤加重，IL-6、STAT3蛋白表达升高，充分验证了麻杏石甘汤对CVA 大鼠的治疗作用与抑制IL-6/STAT3轴活化有关。

TRPV1 是瞬时受体感受器电位通道的成员，可被多种刺激内源性炎症因子等激活，TRPV1 的激活会引起咳嗽反射反应，形成咳嗽高敏感性，也会诱导神经肽的释放，造成气管黏膜水肿、支气管收缩等[20]。在急性发作期，感觉神经细胞的TRPV1被激活，引起Ca2+内流和动作电位产生，诱发了咳嗽反射，而在慢性持续期，过敏原作用于TRPV1，介导胞内转录和磷酸化等级联反应，导致了气道高反应性和气道重塑[6，21-22]。本研究发现，CVA 大鼠肺组织TRPV1 蛋白表达升高，麻杏石甘汤可以降低CVA 大鼠TRPV1 的表达，减轻咳嗽的敏感性。

综上所述，麻杏石甘汤可有效改善大鼠咳嗽变异性哮喘，其机制与抑制IL-6/STAT3 信号通路活化及TRPV1高表达有关。