柴胡加龙骨牡蛎汤对肝郁大鼠肝脏脂质代谢及SREBP-1c/FAS信号通路的影响

洪 捷,蔡萧君

(黑龙江省中医药科学院,黑龙江 哈尔滨 150000)

抑郁症是抑郁障碍的一种典型状况,心境低落、兴趣丧失以及精力缺乏是其最主要的症状,还可出现睡眠障碍、反应迟缓等[1-3]。该病并非单一的功能性精神障碍,涉及因素众多,与遗传、心理、生物化学和社会环境等因素都有紧密的联系[4-5]。固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)及脂肪酸合酶(FAS)作为主要调控脂肪酸合成的基因和催化脂肪酸合成反应的限速酶在肝脏脂质代谢中的调控作用备受关注。柴胡加龙骨牡蛎汤为和解清热、镇惊安神的经典方剂,具有安神、解郁、改善肝脏脂质代谢的功效,但对抑郁症患者肝脏脂质代谢的影响和作用途径尚未明确。本实验探究了柴胡加龙骨牡蛎汤对肝郁大鼠肝脏脂质代谢的影响及其作用机制,以期为临床应用提供实验依据。

1 实验材料与方法

1.1动物 SPF级8周龄SD大鼠50只,体重(200±20)g,购于哈尔滨医科大学实验动物学部,许可证号:SCXK(黑)2019-001。大鼠饲养于黑龙江省中医药科学院SPF级动物房,室温维持20～25 ℃,湿度45%～55%,12 h昼夜交替灯光,自由饮水、摄食。本实验得到黑龙江省中医药科学院动物伦理委员会的批准,审批号:SYXK(黑)2016-008。

1.2药物 柴胡加龙骨牡蛎汤由柴胡25 g(批号:18100014)、龙骨25 g(批号:19056424)、牡蛎25 g(批号:19056614)、人参10 g(批号:19071681)、桂枝15 g(批号:18100164)、茯苓15 g(批号:19071191)、清半夏10 g(批号:19052351)、黄芩10 g(批号:19020124)、大黄6 g(批号:18110294)、生姜10 g(批号:18100154)、大枣5 g(批号:19046814)组成,配方颗粒购于江阴天江药业有限公司。按照人与动物用药量关系换算后,将配方颗粒碾细后加入蒸馏水,于100 ℃恒温水浴锅中加热至完全溶解,制备生药量为0.26 g/mL的药液并于4 ℃冰箱保存备用。

1.3试剂 苏木素-伊红(HE)、改良油红O染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司,货号分别为G1120、G1261);总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司,货号分别为A111-1-1、A110-1-1、A113-1-1、A112-1-1); PrimeScripTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)试剂盒、TB Green®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)试剂盒(日本Takara公司,货号分别为RR037Q、RR420Q); SREBP-1c抗体、FAS抗体、 GAPDH 抗体(武汉三鹰生物技术有限公司,货号分别为66875-1-Ig、10624-2-AP 、60004-1-lg);HRP标记羊抗兔二抗(北京索莱宝科技有限公司,货号:SE134)。

1.4仪器 自制100 cm×100 cm×40 cm敞箱;悬尾仪、摄像头(江苏赛昂斯生物科技有限公司);CUT4062型石蜡切片机(德国 SLEE公司);冰冻切片机(Thermo CRYOSTAR NX50);LEICA 819型切片刀(上海徕卡仪器有限公司);载玻片(Servicebio);JA31002型电子精密天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);BX41 型荧光显微镜(日本Olympus 公司);LINEGENE 9600型Real-time PCR仪(日本大和博日公司);M20型多功能酶标仪(奥地利Ttcan公司);DYCP-31DN型电泳仪、DYCZ-26B型垂直电泳槽、DYY-6C型电泳仪电源(北京六一仪器厂);HD-100型恒温金属浴(杭州博日公司);Quantity One软件、ACDSee 5.0软件、Versa Doc显影仪器(美国Bio-Rad公司);凝胶成像系统(美国伯乐公司)。

1.5实验方法 将50只预饲养7 d的大鼠随机分为空白组、模型组、氟西汀组、柴胡加龙骨牡蛎低剂量组、柴胡加龙骨牡蛎高剂量组,每组10只。空白组正常喂养,不给予其他干预。其余组大鼠采用慢性温和不可预知刺激(CUMS)方法建立肝郁模型,即每天从8项[禁水24 h、禁食24 h、黑白颠倒24 h、悬尾5 min、潮湿垫料24 h、电击(电流强度2 mA,每隔10 s电击4 s,重复2次)、45°倾斜鼠笼24 h、4 ℃冰水游泳5 min]刺激方法中随机选择1种刺激大鼠,连续3 d不重复,连续刺激28 d。造模完成后,参照文献[6],氟西汀组每天给予盐酸氟西汀0.003 g/kg灌胃,柴胡加龙骨牡蛎低、高剂量组每天给予柴胡加龙骨牡蛎汤1.625 g/kg和3.25 g/kg灌胃,空白组和模型组给予等体积的生理盐水灌胃,均1次/d,连续灌胃4周。

1.6检测指标及方法

1.6.1体重 分别于造模前、成模后及末次灌胃结束后称量各组大鼠体重。

1.6.2行为学表现 分别于造模前、成模后及末次灌胃结束后进行以下实验检测。

1.6.2.1糖水偏嗜实验 实验前1 d给予每只大鼠2瓶均装有1%蔗糖水的外观、体积完全相同的水瓶(200 mL)完成训练,实验当天将其中一瓶糖水换成等体积蒸馏水并且每只大鼠开始禁食,次日测量糖水、纯水前1d的消耗量,计算各组大鼠糖水偏嗜率。糖水偏嗜率=糖水消耗量/总液体(糖水+纯水)消耗量×100%。

1.6.2.2旷场实验 在安静环境中,将大鼠置于消毒后不透光敞箱底部中心方格内,待其适应环境后,采用Anilab软件分析每只大鼠规定时间内的运动轨迹和行为,计算大鼠5 min内穿越底面方格数(水平活动得分)及前肢腾空或攀附在箱壁次数(垂直活动得分)。

1.6.2.3悬尾实验 将大鼠尾部距末端约1 cm处用医用胶布缠绕,并固定在桌面上方约50 cm处的悬尾仪上,使其呈头倒式位,利用摄像头观察大鼠在3 min内的悬尾不动时间并记录,实验结束后使用75%酒精清洁设备。

1.6.3肝脏组织病理形态及脂质沉积情况 行为学检测结束后处死大鼠,取肝脏并固定于4%多聚甲醛溶液中,之后制成蜡块,切4 μm切片,常规脱蜡、水化、HE染色、脱水后,中性树胶封片,显微镜下观察组织形态。另取部分4%多聚甲醛溶液固定的肝脏,蔗糖置换后包埋,将包埋后的肝脏固定于冰冻切片机上,行厚5 μm的横断面切片,油红O染色试剂盒染色,封片后在显微镜下观察肝脏中脂质沉积情况。

1.6.4血脂指标水平 大鼠处死前取血,将采血管在37 ℃下静置2 h使血液凝固,将采血管置于4 ℃冰箱过夜,血清自然析出后,在4 ℃下3 500 r/min离心10 min,使用移液枪吸取上清液置于干净的EP管中,储藏在-80 ℃。采用相应生化检测试剂盒检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

1.6.5肝脏组织中SREBP-1c和FAS蛋白表达情况 采用Western blot法测定: 取适量肝脏组织于EP管中,加入细胞裂解液裂解后研磨,于冰上静置30 min。称重配平后,4 ℃下12 000 r/min离心30 min,吸取上清液进行分装,保存于-80 ℃冰箱。运用BCA法测定目的蛋白的蛋白样品浓度并用稀释液调整至相同浓度,加入上样缓冲液,100 ℃金属浴10 min后备用。用12%的预制胶进行180 V恒压电泳,当溴酚蓝指示剂迁移至胶底部时停止电泳,然后用“三明治”法进行220 mA恒定电流转膜,共90 min。转膜结束后,将PVDF膜用快速封闭液进行封闭。然后将经TBST清洗过的PVDF膜置于稀释后的目的蛋白一抗内,4 ℃摇床过夜孵育。第2天用TBST洗膜3次,每次10 min,加入二抗室温避光慢摇1 h,后滴加ECL超敏发光液进行显影。用Image J软件对显影后的条带进行灰度分析,并用Graphpad Prism软件制作柱状图。

1.6.6肝脏组织中SREBP-1c和FAS mRNA表达情况 采用RT-PCR法检测:取适量肝脏组织,加入Trizol试剂提取总RNA,严格按照PrimeScripTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒的操作方法在冰上进行RT反应液的配置,并置于PCR反应管内,转入PCR仪进行反转录反应,反应条件:37 ℃ 15 min×3,85 ℃ 5 s,4 ℃。将反转录合成好的cDNA进行下一步RT-PCR反应。目的基因及内参均上样3个复孔。PCR反应条件:95 ℃预变性30 s,1个循环;95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,40个循环。选用GAPDH作为内参,用2-ΔΔCT计算各目的基因的相对表达量。PCR引物序列见表1。

表1 引物序列

1.7统计学方法 实验数据分析采用SPSS 26.0统计软件。计量资料呈正态分布、方差齐则采用单因素方差分析,组间比较采用最小显著差异法;方差不齐则采用Dunnett T3法;数据呈非正态分布时,采用秩和检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组大鼠体重比较 成模后,各造模组大鼠体重均明显低于空白组(P均<0.05);灌胃结束后,模型组大鼠体重明显低于空白组(P<0.05),各药物组大鼠体重均明显高于模型组(P均<0.05),氟西汀组、柴胡加龙骨牡蛎高剂量组大鼠体重均明显高于柴胡加龙骨牡蛎低剂量组(P均<0.05)。见表2。

表2 空白组和肝郁各组大鼠体重比较

2.2各组大鼠糖水偏嗜率比较 成模后,各造模组大鼠糖水偏嗜率均明显低于空白组(P均<0.05);灌胃结束后,模型组大鼠糖水偏嗜率明显低于空白组(P<0.05),各药物组大鼠糖水偏嗜率均明显高于模型组(P均<0.05),氟西汀组、柴胡加龙骨牡蛎高剂量组大鼠糖水偏嗜率均明显高于柴胡加龙骨牡蛎低剂量组(P均<0.05)。见表3。

表3 空白组和肝郁各组大鼠糖水偏嗜率比较

2.3各组大鼠旷场实验水平运动得分和垂直运动得分比较 成模后,各造模组大鼠水平运动得分和垂直运动得分均明显低于空白组(P均<0.05);灌胃结束后,模型组大鼠水平运动得分和垂直运动得分均明显低于空白组(P均<0.05),氟西汀组大鼠水平运动得分高于模型组但差异无统计学意义(P>0.05), 各药物组大鼠垂直运动得分均明显高于模型组(P均<0.05),氟西汀组、柴胡加龙骨牡蛎高剂量组大鼠垂直运动得分均明显高于柴胡加龙骨牡蛎低剂量组(P均<0.05)。见表4及表5。

表4 空白组和肝郁各组大鼠旷场实验水平运动得分比较分)

表5 空白组和肝郁各组大鼠旷场实验垂直运动得分比较分)

2.4各大鼠悬尾实验不动时间比较 成模后,各造模组大鼠悬尾不动时间均明显长于空白组(P均<0.05);灌胃结束后,模型组大鼠悬尾不动时间明显长于空白组(P<0.05),各药物组大鼠悬尾不动时间均明显短于模型组(P均<0.05),氟西汀组、柴胡加龙骨牡蛎高剂量组大鼠悬尾不动时间均明显短于柴胡加龙骨牡蛎低剂量组(P均<0.05)。见表6。

表6 空白组和肝郁各组大鼠悬尾实验不动时间比较

2.5各大鼠肝脏组织病理形态及脂质沉积情况比较 HE染色:空白组大鼠肝细胞排列整齐,细胞核位于中央,未见脂肪空泡;模型组大鼠肝细胞肿胀变形,细胞核位于边缘,胞内有数量不等脂滴空泡,肝细胞呈气球样变;与模型组相比,各药物组病变均有不同程度减轻,胞内脂滴减少,细胞质、胞膜清晰,其中柴胡加龙骨牡蛎高剂量组和氟西汀组病变减轻更明显。油红O染色:空白组大鼠肝脏细胞内未见油红着色的脂滴;模型组可见大量油红着色的红色脂滴;与模型组相比,各药物组油红着色的脂滴减少,其中柴胡加龙骨牡蛎高剂量组和氟西汀组油红着色的脂滴减少更明显。见图1。

图1 空白组和肝郁各组大鼠肝脏组织病理形态和脂质沉积情况(×200)

2.6各组大鼠血脂指标比较 与空白组比较,模型组大鼠血清TG、TC、LDL-C水平均明显升高(P均<0.05),血清HDL-C水平明显降低(P<0.05);各药物组大鼠血清TG、TC、LDL-C水平均明显低于模型组(P均<0.05),且氟西汀组、柴胡加龙骨牡蛎高剂量组大鼠血清TG、TC、LDL-C水平均明显低于柴胡加龙骨牡蛎低剂量组(P均<0.05);各药物组大鼠血清HDL-C水平均明显高于模型组(P均<0.05),且氟西汀组、柴胡加龙骨牡蛎高剂量组大鼠血清HDL-C水平均明显高于柴胡加龙骨牡蛎低剂量组(P均<0.05)。见表7。

表7 空白组和肝郁各组大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C水平比较

2.7各组大鼠肝脏组织中SREBP-1c和FAS蛋白表达情况比较 模型组大鼠肝脏组织中SREBP-1c和FAS蛋白相对表达量均明显高于空白组(P均<

0.05);各药物组大鼠肝脏组织中SREBP-1c和FAS蛋白相对表达量均明显低于模型组(P<0.05),氟西汀组、柴胡加龙骨牡蛎高剂量组大鼠肝脏组织中SREBP-1c和FAS蛋白相对表达量均明显低于柴胡加龙骨牡蛎低剂量组(P均<0.05)。见图2。

图2 空白组和肝郁各组大鼠肝脏组织中SREBP-1c和FAS蛋白表达情况

2.8各组大鼠肝脏组织中SREBP-1c和FAS mRNA表达情况比较 模型组大鼠肝脏组织中SREBP-1c和FAS mRNA相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05);各药物组大鼠肝脏组织中SREBP-1c和FAS mRNA相对表达量均明显低于模型组(P<0.05),氟西汀组、柴胡加龙骨牡蛎高剂量组SREBP-1c mRNA相对表达量和氟西汀组FAS mRNA相对表达量均明显低于柴胡加龙骨牡蛎低剂量组(P

均<0.05)。见表8。

表8 空白组和肝郁各组大鼠肝脏组织中SREBP-1c和FAS mRNA相对表达量比较

3 讨 论

中医学认为,情志与五脏有密切联系,七情失调造成肝失疏泄、脾失健运、精血暗耗或神失所养,肝气不舒,可以导致郁症的发生[7]。《素问·至真要大论》提出“疏其气血,令其条达”,说明疏肝行气解郁是抑郁症的主要治疗方法之一。柴胡加龙骨牡蛎汤是沿用至今的中医治疗抑郁症的有效方剂,方中柴胡行气解郁,龙骨、牡蛎镇静安神,黄芩清肝胆之热,大黄清泄郁热,桂枝、茯苓通阳化气,半夏、生姜和胃降逆,铅丹镇惊定搐,人参、大枣扶助正气。全方疏肝清热、宁心安神。现代药理学研究表明,柴胡中有效成分柴胡皂苷a可以改善CUMS模型大鼠抑郁样行为,调节大鼠脑内海马中5-羟色胺(5-HT)和去甲肾上腺素(NE)的表达[8];人参中有效成分人参皂苷Rg1可显著降低CUMS模型大鼠血清皮质酮水平,提高血清睾酮水平及前额叶皮质和海马体中的糖皮质激素受体蛋白水平,显示出抗抑郁活性[9];黄芩中的黄芩苷及黄芩素可显著改善CUMS模型大鼠抑郁样行为[10]。颉彦鹏[6]研究发现,柴胡加龙骨牡蛎汤可通过上调CUMS模型大鼠海马区5-羟色胺2A受体(5-HT2AR)和钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱα(CaMKⅡα)的表达,改善海马神经元可塑性,增加大鼠自主活动时间[7]。吴圆圆等[11]报道,柴胡加龙骨牡蛎汤可能通过调控炎症因子IL-1β、IL-6、IL-18 、IL-2表达及单胺类神经递质5-HT2AR、多巴胺受体 D2(DARD2)表达发挥抗抑郁作用。任庆萍等[12]研究表明,柴胡加龙骨牡蛎汤联合艾司西酞普兰不仅能有效提高急性脑梗死伴焦虑抑郁障碍患者血清单胺类神经递质水平与日常生活活动能力,还能改善患者的焦虑抑郁程度与神经功能。另有多项临床研究表明,柴胡加龙骨牡蛎汤可以降低血清TG、TC、LDL-C水平[13-15]。

抑郁症发病机制复杂,经过大量细致深入的研究仍未能明确,相关研究多集中在下丘脑-垂体-肾上腺轴、单胺类神经速质、神经营养因子以及脑肠轴等几个方面,近年来针对抑郁症和肝脏之间关系的研究逐渐增多。Lee等[16]的一项纳入10231名各类肝病患者的队列研究表明,抑郁症与慢性肝病有强相关性,Elwing等[17]的研究也印证了这一点。另有调查抑郁症与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)患者组织学特征严重程度的研究表明,更严重的肝细胞气球样变性与抑郁症有关,亚临床重度抑郁症(MDD)患者出现肝细胞气球样变性的可能性是非抑郁症患者的2.1倍,临床MDD患者的可能性是非抑郁症患者的3.6倍[18]。这些研究说明抑郁症与肝脏之间有着密不可分的联系。

肝脏是机体参与代谢的重要器官,参与内源性脂肪的合成及转运,在维持机体代谢稳态中发挥重要作用[19]。Chaudhary等[20]调查的高血脂症患者中,超过46%的患者TC水平升高,近20%接受治疗的患者TC水平没有达到预期目标。脂肪酸合成与脂肪细胞分化是肝脂代谢的关键代谢途径。甾醇调节元件结合蛋白家族(SREBPs)属于内质网连接蛋白,能与固醇调节元件发生特异性结合,其具有3种同型异构体。SREBP-1c是3种同型异构体之一,主要存在于肝脏、脂肪组织和骨骼肌中,是控制脂肪链合成和肝脏脂质生成的重要转录因子[21-22],广泛参与机体的脂质代谢,并能通过调节脂肪代谢相关酶来调控体内的脂肪合成,促进TG正平衡[23]。SREBP-1c作为调节FAS酶表达的重要转录因子,在肝脏TG合成中起着至关重要的作用[24]。

FAS是一种十分重要的与脂肪合成有关的限速酶,催化脂肪酸的合成,是TG合成的关键酶[25]。FAS是SREBP-1c的下游因子,表达受其上游核转录因子SREBP-1c的调控。脂质代谢紊乱,游离脂肪酸蓄积过多时会激活SREBP-1c,SREBP-1c激活后可促进FAS基因的转录表达,FAS过度表达会促进TG的合成,引起体内脂肪酸大量合成,导致生物体内脂肪的沉积[26],肝细胞内脂肪的异常沉积会形成脂肪肝[27]。研究表明,下调NAFLD大鼠SREBP-1c及FAS的表达,可以减轻肝脏脂肪沉积[28]。Chen等[29]研究表明,金松酸可以通过激活SREBP-1c/FAS信号通路改善大鼠的脂质代谢。Xu等[30]研究显示,田蓟苷可通过降低SREBP-1c及FAS的表达来改善早期肥胖小鼠的NAFLD。Wang等[31]发现Menin过表达可抑制脂肪合成基因SREBP-1c及FAS等基因表达,从而抑制肝细胞中的脂肪积累。Bechmann等[32]研究发现,阻断SREBP-1c介导的信号通路,抑制肝脏FAS的过度表达,可改善脂肪肝,减轻肝脂肪变性。

由于人类疾病的发生机制具有复杂性,易被不可控因素干扰,因此为了更好地了解抑郁症对肝脏脂质代谢的影响,需要用被诱导的动物模型进行评估,以验证在这些模型中是否存在类似的变化。既往研究表明,CUMS模型是模拟人类生活中频繁的、低强度、不愉快的精神刺激而建立的应激抑郁动物模型,会导致啮齿动物的行为改变,这与抑郁症的症状相似,因此这个模型被认为是研究抑郁症的最佳啮齿动物模型之一[33]。有实验数据显示,CUMS模型大鼠常伴有糖脂代谢、蛋白质代谢的改变,尤其以脂代谢为主,而CUMS模型大鼠的体重增长缓慢、糖水偏嗜率降低、旷场自主活动减少等行为表现与临床上肝郁证患者出现的食少纳呆、不欲饮食、倦怠乏力等症状可对应[34],因此CUMS模型可以作为肝郁证动物模型来进行相关研究。本研究中通过对小鼠实施禁食禁水、电击、悬尾等不可预知刺激建立了CUMS模型,发现这些刺激可导致大鼠体重减轻,出现明显抑郁行为,肝细胞脂肪空泡增加,肝脏出现异常脂肪沉积,血清TG、TC、LDL-C水平升高, 血清HDL-C水平降低,肝脏组织中SREBP-1c、FAS蛋白及mRNA相对表达量增加,表明抑郁状态会增加大鼠肝脏内的脂肪沉积,抑郁症与肝脏脂质代谢有非常密切的关系,可激活SREBP-1c/FAS通路;而柴胡加龙骨牡蛎汤可以增加CUMS模型大鼠在旷场实验中的活动总路程,缩短大鼠在悬尾实验中的不动时间,有效改善大鼠的抑郁行为,能有效调节肝脏异常脂质代谢,下调肝脏组织中SREBP-1c、FAS蛋白及mRNA表达。说明柴胡加龙骨牡蛎汤具有良好的抗抑郁效果,能明显改善肝脏的异常脂质代谢,其改善肝脏异常脂质代谢的机制可能与调节SREBP-1c/FAS信号通路有关。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。