栀子花多糖的提取工艺及其脂代谢调节作用

柳宛艺, 邓湘铸, 尚煜昆, 黄 超, 吴思蓥, 黄 维,2

(1.福建农林大学生命科学学院;2.自然生物资源保育利用福建省高校工程研究中心,福建 福州 350002)

栀子(GardeniajasminoidesEllis)是我国八大香花之一,是一种药食同源植物,其果、花等皆有药效。栀子花味苦、性寒,归肺、肝经,有清肺止咳、凉血解毒的功效[1-2]。目前对栀子花药效的研究较少[3-4]。研究[5-7]表明:栀子花的主要成分有多糖、黄酮、环烯醚萜、三萜、酚酸等,其中,多糖占栀子花干质量的10%以上,高于其他活性成分。植物多糖具有抗炎、抗菌、抗氧化、降血糖、降血脂、提高人体免疫力等功效[8-10]。植物多糖的提取方法主要有溶剂提取法、微波提取法、酶解辅助提取法、超声波提取法等,而超声波提取法在植物多糖中的应用较为广泛[11-12]。本研究拟采用超声波提取法研究栀子花多糖的提取工艺,并采用脂肪堆积细胞模型对栀子花多糖的降血脂功效进行研究,以期为栀子花多糖等功能性食品的开发与利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

栀子花采自福建省宁德市福鼎市贯岭镇黄栀子生产基地。

人肝癌细胞HepG2购于中国科学研究院(上海)细胞库;DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、胰蛋白酶、青霉素-链霉素溶液,购自美国HyClone公司;噻唑兰[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、油酸(oleic acid,OA)购于美国 Sigma公司;甘油三酯(triacylglycerol,TG)和总胆固醇(total cholesterol,TC)试剂盒均购于南京建成生物工程研究所;高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)试剂盒购于南京建成生物工程研究所;Bradford蛋白含量测定试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司;牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)购于上海源叶生物科技有限公司;辛伐他汀(批号171101)购于国药集团汕头金石制药有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

主要仪器包括超声波仪(KQ-600DE,昆山市超声仪器有限公司)、二氧化碳培养箱(美国赛默飞世尔科技公司)、倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)、酶标仪(美国赛默飞世尔科技公司)、台式离心机 (TGL-16G,上海安亭科学仪器厂)、超纯水机(Millipore Synergy-UV,美国默克密理博公司)、SJIA-10N冷冻干燥机(宁波市鄞州双嘉仪器有限公司)和电子天平(BS-210S,北京赛多利斯仪器系统有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 栀子花干粉的制备 将新鲜的栀子花于阴凉处摊开、晾干;置于60 ℃烘箱干燥24 h,用中药打粉机粉碎,过40目筛;采用索氏提取器在50 ℃下用石油醚将栀子花干粉回流2次,每次2 h;再用布氏漏斗抽滤,最后将栀子花干粉放入烘箱,60 ℃下烘干,备用。

1.3.2 单因素试验 设定液料比为5～30 mL·g-1,提取温度为30～80 ℃,超声功率为100～600 W,提取时间为30～180 min。称取栀子花干粉3.0 g于250 mL具塞锥形瓶中,混合后放入超声波仪器中提取多糖。

1.3.3 响应面试验 按照中心组合原则选择各因素的3个水平设计试验,设置3个重复,使用Design Expert 8.0.6软件对栀子花多糖的提取结果进行分析、优化。

1.3.4 多糖含量测定[13]称取105 ℃下烘干后的标准葡萄糖40 mg,用蒸馏水溶解于1 000 mL容量瓶中,配制40 μg·mL-1葡萄糖溶液(对照)。称取苯酚5 g,用蒸馏水定容于100 mL容量瓶中并摇匀,配制质量分数为5%的苯酚溶液。分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 40 μg·mL-1葡萄糖溶液,置于试管中;以蒸馏水补至1.0 mL,加入1 mL 5%(质量分数)苯酚及5.0 mL浓硫酸,摇匀,放置20 min;在490 nm波长下测量光密度。以葡萄糖含量为横坐标,光密度为纵坐标,绘制如下标准曲线:

Y=0.146 9X+0.108 2(R2=0.998 3)

式中:X为葡萄糖质量浓度(μg·mL-1);Y为D490 nm。

取上述试验获得的栀子花水提液1 mL,用蒸馏水稀释于 25 mL容量瓶内;再从该容量瓶中取1 mL溶液于试管中,分别与苯酚、浓硫酸发生反应,测定D490 nm,并根据葡萄糖标准曲线计算栀子花提取液中多糖的含量。

1.3.5 脂肪堆积细胞试验[14](1)细胞存活率测定:采用96孔板,每孔加入200 μL HepG2细胞液(5×104个·mL-1),培养过夜;待细胞贴壁后,弃去培养液。设置无细胞培养基为对照1,不加药培养基为对照2。

将提取工艺优化后获得的栀子花多糖用70%(体积分数)乙醇沉淀后低温冷冻、干燥,再用蒸馏水分别配制50、100、150、200、250、300 μg·mL-1的栀子花多糖溶液,对HepG2细胞给药,每孔分别加入180 μL上述栀子花多糖溶液;24 h后每孔分别加入20 μL 5 mg·mL-1MTT溶液;4 h后弃去孔中溶液,用150 μL DMSO溶解,测定D490 nm。根据如下公式计算细胞存活率:

细胞存活率=[D490 nm(处理)-D490 nm(对照1)]/[D490 nm(对照2)-D490 nm(对照1)]×100%。

(2)OA造模剂的制备:吸取100 μL OA于 70 ℃水浴中,振荡后溶解于3.06 mL 0.1 mol·L-1NaOH中,配制100 mmol·L-1OA储备液;称取2.844 g BSA,加入28.44 mL PBS溶液,配制质量分数为10%的BSA溶液;置于55 ℃水浴中,振荡后逐滴加入上述OA储备液,配制10 mmol·L-1的OA溶液。以0.22 μm滤膜过滤OA溶液,-20 ℃下冷冻保存,备用。

(3)OA造模剂浓度的筛选:采用96孔板,每孔加入200 μL HepG2细胞液(5×104个·mL-1),培养过夜,在HepG2细胞贴壁后,弃去培养液。设置无细胞培养基为对照1,不加药培养基为对照2;分别设置500、750、1 000、1 250、1 500、2 000 μmol·L-1OA造模剂为处理组,每组设3个复孔。采用TG检测试剂盒测定TG含量,再采用MTT法测定细胞存活率,筛选出最佳OA造模剂浓度。

(4)栀子花多糖对脂肪堆积细胞脂代谢的影响:采用96孔板,每孔接种200 μL HepG2细胞(5×104个·mL-1)。利用上述筛选出的OA造模剂浓度建立脂肪堆积细胞模型;利用提取工艺优化后获得的50、100、150、200、250、300 μg·mL-1栀子花多糖溶液和50 μg·mL-1辛伐他汀分别对上述脂肪堆积细胞给药;24 h 后根据试剂盒说明书分别测定TG、TC、HDL-C、LDL-C含量和细胞存活率。以未添加OA造模剂的细胞为对照1,以仅添加OA造模剂的细胞为对照2;处理1、处理2、处理3分别为100、150、200 μg·mL-1栀子花多糖溶液,处理4为50 μg·mL-1辛伐他汀溶液。每组设3个复孔。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素试验

分别考察液料比、提取温度、超声功率和提取时间对栀子花多糖提取率的影响。对不同液料比的栀子花溶液提取多糖,在超声功率300 W、提取温度40 ℃条件下提取60 min,多糖提取率随液料比的增大而升高,但液料比大于25 mL·g-1时多糖提取率升高不显著(图1A)。在液料比25 mL·g-1、超声功率300 W、提取时间60 min的条件下,升高提取温度有助于提高多糖提取率;提取温度为70 ℃时多糖提取率达到最大值;而提取温度为80 ℃时提取率不再升高,推测温度过高会引起多糖降解(图1B)。在提取温度70 ℃、液料比25 mL·g-1的条件下,超声功率为500 W时提取率最高,而超声功率为600 W时提取率明显下降,推测超声功率过高会使多糖结构受到破坏(图1C)。在液料比25 mL·g-1、超声功率500 W、提取温度70 ℃的条件下,提取时间为150 min时多糖提取率最大,而提取时间大于150 min时提取率下降,推测提取时间过长会使多糖结构受到破坏(图1D)。

图1 不同提取条件下的栀子花多糖提取率Fig.1 Yield of polysaccharide extracted from G.jasminoides flower under different extraction conditions

2.2 响应面试验

根据单因素试验结果,运用中心组合原则选择液料比(A)、提取温度(B)、超声功率(C)和提取时间(D)的3个水平,分别以-1、0和1表示(表1)。利用Design Expert 8.0.6软件中Box-Behnken模型设计响应面试验,结果见表2。

表1 基于响应面试验的因素水平表Table 1 Factors and levels in the response surface design

表2 栀子花多糖提取的响应面试验结果Table 2 Result of response surface experiment on extraction of polysaccharides from G. jasminoides

采用Design Expert软件对试验结果进行多元回归分析,得到各提取因子与栀子花多糖提取率的回归拟合方程:

Y=17.45-0.11A-0.23B+0.81C+0.66D+0.34AB+0.08AC-0.072AD+0.11BC-0.34BD-0.073CD-0.61A2-0.73B2-0.35C2-0.71D2(R2=0.934 6)。

由回归拟合方程可知,液料比对栀子花多糖提取率的影响最大,其次是超声功率(表3)。由响应面模型可以看出:液料比与提取温度以及提取温度与提取时间之间的相互作用对栀子花多糖提取率的影响较显著(表3)。

表3 回归模型的方差分析1)Table 3 Variance analysis of regression equation

由Design Expert软件分析得出多糖提取的最佳条件为:液料比24.8 mL·g-1,提取温度62.7 ℃,超声功率547.9 W,提取时间138.16 min。这时多糖提取率(理论值)可达17.52%。根据实际情况优化后的提取条件为:液料比25 mL·g-1,超声功率550 W,提取时间140 min,提取温度63 ℃。由验证试验结果可知:多糖平均提取率为17.48%±0.22%,与理论值较接近,其相对标准偏差为4.63%,说明此响应面模型稳定、可靠。

2.3 栀子花多糖对脂肪堆积细胞脂代谢的影响

采用优化后的提取工艺获得不同含量栀子花多糖,醇沉后低温冻干,加入蒸馏水配制成50、100、150、200、250、300 μg·mL-1栀子花多糖溶液。从图2可知:当栀子花多糖的质量浓度不高于250 μg·mL-1时,其对HepG2细胞无抑制作用(P>0.05);当栀子花多糖的质量浓度为300 μg·mL-1时,其对HepG2细胞有显著的抑制作用(P<0.05)。

图2 不同含量栀子花多糖对HepG2细胞存活率的影响Fig.2 Effect of different contents of G. jasminoides flower polysaccharides on survival rate of HepG2 cell

分别配制500、750、1 000、1 250、1 500和2 000 μmol·L-1OA溶液,对HepG2细胞给药, 24 h后检测细胞存活率和TG含量。由表4可知:0～1 250 μmol·L-1OA对细胞存活率无显著影响(P>0.05);与对照2相比,1 500～2 000 μmol·L-1OA显著降低细胞存活率(P<0.05),说明高含量OA对细胞有抑制作用。结果(表4)显示:当OA浓度≥500 μmol·L-1时,HepG2细胞的TG含量均显著提高(P<0.05);OA浓度为1 000 μmol·L-1时,TG含量达到最大值。因此,选择1 000 μmol·L-1作为OA造模剂浓度(表4)。

表4 OA造模剂浓度对HepG2细胞存活率和TG含量的影响1)Table 4 Effect of oleic acid on survival rate and triglyceride content of HepG2 cells

以1 000 μmol·L-1作为脂肪堆积细胞试验的诱导浓度,由表5可知:与对照2相比,随着栀子花多糖含量的提高,脂肪堆积细胞的TG、TC和LDL-C含量均逐渐下降,而HDL-C含量上升,且对细胞存活率无显著影响(P>0.05),表明栀子花多糖对脂肪堆积细胞的脂代谢具有显著的调节作用。

表5 栀子花提取物对脂肪堆积细胞脂代谢的影响1)Table 5 Effect of G.jasminoides flower polysaccharides on fat accumulation cells

3 讨论和小结

黄维等[15]研究表明,液料比、提取温度、超声波功率和提取时间是影响超声波提取植物多糖的关键因素。本研究通过优化蒸馏水与栀子花干粉的液料比、提取温度、超声功率和提取时间,设计响应面法试验。结果表明,液料比和超声波功率对栀子花多糖提取率的影响比较显著,这与大多数研究结果[12]一致。宫宁江等[16]对栀子多糖超声提取工艺进行了优化研究,结果显示,最佳工艺参数为液料比44 mL·g-1、超声功率120 W、提取时间73 min,该工艺条件下栀子多糖的提取率为6.34%±0.09%。本试验得到的最优工艺为液料比25 mL·g-1、超声功率550 W、超声时间140 min、提取温度63 ℃,栀子花多糖的提取率高达17.48%。

肝脏是人体脂肪代谢的重要器官,肝脏内的TG和TC等脂肪类物质可通过三酰甘油转运蛋白形成LDL-C,分泌肝细胞,而HDL-C可降低肝脏细胞的胆固醇含量,降低动脉硬化风险[17-18]。刘畅等[19]利用红树莓提取物抑制HepG2细胞胞内脂肪堆积。甘露珍等[20]研究表明,泽漆提取物能够有效抑制HepG2细胞内脂肪堆积,调节脂质代谢。本研究通过OA造模剂构建人肝癌HepG2细胞脂肪堆积模型,结果显示栀子花多糖能有效降低细胞内TG、TC和LDL-C含量,提高HDL-C含量,表明栀子花多糖对高脂肝细胞脂代谢具有显著的调节作用。但目前对于栀子多糖的降脂机制还不明确,有待于进一步研究。