QuEChERS-HPLC-MS/MS法同时测定韭菜中18种杀菌剂残留

单平阳，宋亚娟，黄月，王磊，石可歆，董浩爽

1.唐山市食品药品综合检验检测中心 （唐山 063000）；2.河北省农产品质量安全检测技术创新中心 （唐山 063000）；3.唐山市功能性农产品产业技术研究院 （唐山063000）

韭菜由于连作栽培，容易发生灰霉病等真菌病害。灰霉病是一种常见韭菜病害，会导致韭菜叶片枯死、湿腐、霉烂，严重时减产30%以上。由于韭菜的种植周期短，药剂使用剂量增加、喷药间隔长，容易导致杀菌剂残留超标，严重影响百姓饮食安全，因此建立一种同步检测韭菜中多种杀菌剂残留的高效、快速分析方法，对评估和预防杀菌剂残留风险至关重要。

国内外关于腐霉利等杀菌剂在茶叶、南果梨、黄瓜、生菜等作物上的残留研究已有诸多报道[1-4]，但前处理方法检测方法多局限于国标方法或手动QuEChERS结合气相色谱-质谱法、气相色谱法等[5-10]。洪泽淳等[11]建立一种GC-MS/MS结合QuEChERS法筛查韭菜中多种农药残留的方法，结果表明，22种农药的平均回收率为61.3%～115.8%，相对标准偏差＜10%。李颜岩等[12]研究表明利用超高效液相色谱-串联质谱法同时测定蔬菜中12种杀菌剂，样品加标回收率为93.6%～ 107.5%，SRSD为0.93%～3.75%。试验选择韭菜生产中可能使用频率较高的杀菌剂作为检测对象，建立快速、高效的杀菌剂QuEChERS-HPLC-MS/MS同步多残留检测技术，旨在为相关国家标准的制定提供理论依据与数据支撑，在保证居民食品安全及提高企业生产规范方面具有积极意义。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

岛津8050型HPLC-MS/MS[岛津科技（中国）有限公司]；HT-200型多管涡旋混匀仪（上海圣科仪器设备有限公司）；SiO-6512型全自动前处理设备（上海净信实业发展有限公司）；3-15型高速离心机（德国Hettich公司）；EVA50A型氮吹仪（美国Organomation Associates公司）；LC-JA/FA型电子分析天平（力辰科技有限公司）；0.22 μm有机滤膜（津腾仪器设备有限公司）。

18种杀菌剂标准品：多菌灵、噻菌灵、乙霉威、三唑醇、嘧霉胺、甲霜灵、腈菌唑、戊唑醇、啶酰菌胺、腐霉利、氟硅唑、烯酰吗啉、腈苯唑、丙环唑、咪鲜胺、肟菌酯、苯醚甲环唑、五氯硝基苯，纯度均≥99.0%，购于国家标准物质中心。有机溶剂均为色谱纯，购于德国试剂公司；无水硫酸镁、氯化钠、乙酸均为分析纯，购于国药化学试剂公司。

1.2 试验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱Phenomenex双苯基柱（50 mm×3.00 mm，2.60 μm）；进样体积2 μL；柱温40 ℃；流动相A为含0.05%甲酸的5 mmol/L甲酸铵溶液，流动相B为甲醇。梯度洗脱：0～0.5 min，10% B；0.5～9.0 min，75% B；9.0～9.1 min，95% B；9.1～10.0 min，10% B；流速0.40 mL/min。

1.2.2 质谱条件

离子模式为电喷雾正离子源ESI+；扫描方式为多反应监测模式（MRM）；雾化气流量2.00 L/min；干燥气流量20.00 L/min；DL管温度240 ℃；电喷雾电压（IS）2 500 V；扫描时间0.1 s。

1.2.3 标准溶液配制

分别准确吸取100 μL 1 000 μg/mL的18种杀菌剂标准品，用乙腈溶液配制10 μg/mL的混合标准储备液，置于4 ℃冰箱保存备用。分别配制0.01，0.02，0.04，0.06和0.08 μg/mL的基质混合标准工作液，现用现配。

1.2.4 样品前处理

称取5.0 g粉碎的韭菜样品，置于50 mL离心管外管中，加入1 mL混合标准溶液，涡旋振荡30 min，混匀，加入10 mL含有5%乙酸的乙腈，加入5.0 g无水硫酸镁，1.5 g氯化钠。内管含有200 mg PSA，300 mg无水硫酸镁和150 mg C18，将离心管放入自动QuEChERS前处理装置中，剧烈振荡25 min充分净化，去除色素，取1.0 mL上清液氮吹近干，用10%甲醇溶液定容，过0.22 μm滤膜，滤液上机测定。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

通过对18种杀菌剂分别进行正负离子扫描，根据灵敏度分析，最终选择ESI+离子源。分别取1 μg/mL的18种杀菌剂标准溶液在正离子模式下进行全扫描，得到18种杀菌剂的一级质谱图，选择响应最高的离子作为母离子，优化去簇电压（DP）。在多反应监测模式下（MRM），选择丰度较高的2个离子作为子离子，实现定性和定量，并优化碰撞能（CE）。质谱参数见表1。

表1 18种杀菌剂的质谱参数

2.2 色谱条件的优化

比较Phenomenex双苯基色谱柱（50 mm×3.00 mm，2.60 μm）和Shi-pack GIST C18色谱柱（100 mm×2.1 m，2 μm）对待测物的分离效果，结果表明，18种杀菌剂在Phenomenex双苯基色谱柱上的分离效果和峰形最好（如图1所示）。因此，试验选择Phenomenex双苯基色谱柱分析待测物。

图1 18种杀菌剂的HPLC-MS/MS总离子图

2.3 方法学验证

2.3.1 线性范围、检出限和定量限

基质效应可分为离子增强效应和离子抑制效应，在HPLC-MS/MS使用ESI离子源分析中离子抑制效应尤为突出，消除基质效应的方法包括加入分析保护剂、增加基质净化、基质标准曲线校正等方法。试验采用样品基质匹配标准曲线进行校正，以消除基质效应的影响。结果表明，18种杀菌剂在质量浓度范围0.01～ 0.08 μg/mL时具有良好线性关系，相关系数（r）均≥ 0.999 0。结果显示，18种杀菌剂的检出限（SLOD）为0.11～0.87 μg/kg，定量限（SLOQ）为0.65～1.89 μg/kg（表2）。

表2 18种杀菌剂的线性关系、相关系数、检出限和定量限

2.3.2 方法的回收率和精密度

在优化条件下，在5.0 g空白韭菜样品中添加5，10和50 μg/kg这3种水平的18种杀菌剂混合标准溶液进行试验，每个浓度水平重复测定6次，考察回收率和精密度。由表3可知，3个添加水平的平均回收率在87%～108%之间，相对标准偏差为2.1%～4.5%，方法的准确度和精密度均满足残留分析的要求。

表3 18种杀菌剂添加回收率和精密度（n=6）

3 结论

试验选用Phenomenex双苯基色谱柱分离，利用自动QuEChERS法对韭菜样品进行净化，减少基质干扰提高定性定量准确度。通过优化分析条件，建立韭菜中18种杀菌剂残留的HPLC-MS/MS检测方法。18种杀菌剂在0.01～0.08 μg/mL范围内线性关系良好，方法检出限为0.11～0.87 μg/kg，定量限为0.65～1.89 μg/kg。5.0，10.0和50.0 μg/kg这3个添加水平的平均回收率为87%～108%，相对标准偏差为2.1%～4.5%。该方法前处理操作简单、灵敏度高和准确度，可用于同步韭菜中18种杀菌剂残留批量检测分析。