福建省36株人源猪链球菌分离株病原学特征分析

梁雪晨,高亚东,李曲文,,3

猪链球菌是一种重要的人兽共患病病原菌,最早报道于1954年,1968年在丹麦报告首例人感染猪链球菌病例[1]。猪链球菌宿主存在多样性,主要宿主是猪,定植部位为猪的上呼吸道。人感染猪链球菌的主要途径是呼吸道和接触,例如通过破损的伤口、黏膜、消化道、鼻咽腔等。感染猪链球菌会引起化脓性关节炎、听力丧失、败血症等疾病,甚至威胁生命。根据荚膜多糖抗原差异,将猪链球菌分为29个血清型,为1-19、21、23-25、27-31和1/2[2]。其中1型、1/2型、2型、7型、9型和14型为引起猪链球菌病的主要血清型。1998年和2005年2次疫情暴发,均为猪链球菌2型[3]。猪链球菌发病率与致病性和其数量无关,而与其毒力因子相关。猪链球菌毒力因子众多,根据其携带毒力因子的不同,被分为高致病性毒株、低致病性毒株和无致病性毒株[4]。常用多位点序列分析分型(Multi-locus sequencing typing,MLST)测定细菌的多个管家基因获得菌株的序列型(sequence type,ST)对其进行分类。随着高通量测序成本的降低,全基因组测序技术广泛运用于分析猪链球菌的流行病学、致病性、耐药性以及进化等研究。猪链球菌血清型众多,疫苗防治效果不理想,养殖场常在饲料中添加抗生素进行预防。抗生素的滥用导致猪链球菌产生了耐药性,甚至出现多重耐药菌株[5],因此调查和分析猪链球菌的耐药性与耐药基因不仅对临床治疗猪链球菌感染引起的相关疾病有极大帮助,还有助于新型抗菌药物的研发。自2005-2023年期间,福建地区共报告了36例人感染猪链球菌的病例。为了解福建省人源猪链球菌分离株毒力基因、耐药情况,进行了全基因组分析、药敏试验等研究,以了解福建流行菌株的病原特征,对福建地区的猪链球菌防控提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 福建省2005-2023年分离自人的猪链球菌分离株,共计36株(菌株标号为1-36号,见表1),均通过PCR、质谱、生化鉴定为猪链球菌。

表1 福建省人源猪链球菌信息表

1.2 主要仪器设备 荧光PCR仪购自中国杭州博日科技股份有限公司;常规PCR仪购自美国ABI有限公司;全自动快速生物质谱检测仪购自BRUKER公司;链球菌药敏试剂板DL-96STR MIC购自珠海迪尔生物工程股份有限公司;猪链球菌荧光PCR核酸检测试剂盒购自深圳生科原有限公司;血琼脂平板购自北京陆桥技术股份有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 菌株的复苏 将实验室保存的36株猪链球菌菌株分别划线接种于血琼脂平板上,放入37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养18～24 h。

1.3.2 DNA提取 使用凯杰基因组试剂盒,参照试剂盒说明书提取细菌基因组,用于毒力、耐药、基因组测定等实验。

1.3.3 毒力因子检测 选择猪链球菌主要的毒力基因(mrp、sly、epf、gdh、fpbs、gapdh)进行 PCR 检测,参考文献[6]合成引物。引物由生工生物工程股份有限公司合成。PCR 反应体系(23 μL):模板 DNA 3.0 μL,上、下游引物各 0.5 μL,2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL,ddH2O 6.5 μL。PCR 反应结束后,取 5 μL 产物进行 1.2%琼脂糖凝胶电泳,通过凝胶成像系统观察并记录结果。

1.3.4 全基因组测序 由上海生工生物工程股份有限公司有限公司进行细菌基因组框架图测序。使用Illumina Hiseq进行基因组二代测序,对测序的原始数据通过FastQC进行质量评估,使用SPAdes拼接二代测序数据,拼接的序列用于后续分析。

1.3.5 药敏试验 药敏实验按照链球菌药敏试剂盒微量肉汤稀释法(MIC法)说明书进行,质控菌株为肺炎链球菌ATCC49619。耐药折点值参考2020版美国临床实验室标准协会(CLSI)药敏实验判断标准中肺炎链球菌的判断标准。

1.3.6 耐药基因及耐药基因预测 使用CARD网站预测菌株可能携带的林可酰胺类、大环内酯类、四环素类、氯霉素类等耐药基因,并通过ICEfinder网站预测可能含有的ICE。

1.3.7 多位点序列分型 将全基因组序列结果在PubMLST网站进行7个管家基因(mutS、recA、aroA、cpn60、thrA、dpr、gki)及序列ST型查询。将全基因组测序数据上传至BacWGSTdb网站绘制SNP进化树(参考菌株A7_CP002570_ST7)。使用iTOL(https://itol.embl.de/)对进化树进行美化。

1.3.8 统计分析 采用Excel 2013软件录入实验室检测结果和全基因组分析数据,进行统计分析。

2 结 果

2.1 毒力基因检测 通过PCR对36株猪链球菌分离株mrp、sly、epf、gdh、fpbs、gapdh毒力基因进行了检测,其携带率分别为55.6%、80.6%、86.1%、100%、100%、100%。sly+epf+mrp+为优势毒力基因型,共15株,占47.1%,其次为sly+epf+mrp-毒力基因型,共10株,占27.8%,sly-epf+mrp-毒力基因型共4株,sly+epf-mrp-、sly-epf+mrp+与sly+epf-mrp+毒力基因型各2株,sly-epf-mrp+毒力基因型1株。

2.2 MLST分型及毒力基因携带模式 36株猪链球菌的MLST分析结果显示,有5种不同的ST型,其中以ST1型58.3%(21/36)与ST7型30.6%(11/36)最为常见。

36株猪链球菌分离株ST型与血清型和毒力基因型的关系见表2,ST1主要毒力基因型为sly+epf+mrp-与sly+epf+mrp+;ST7主要毒力基因型为sly+epf+mrp+;ST25毒力基因型是sly-epf-mrp+与sly-epf+mrp-。

表2 猪链球菌ST型与血清型和毒力基因型分布

2.3 耐药表型及基因型 36株药敏结果显示:对四环素的耐药率高达100%(36/36),红霉素83.3%(30/36)、克林霉素83.3%(30/36),复方新诺明耐药率55.6%(20/36),氯霉素11.1%(4/36),头孢噻肟、美罗培南、头孢吡肟、万古霉素、青霉素均为2.8%(1/36)。36株猪链球菌中7重耐药菌株有1株,占比2.8%(1/36),5重耐药菌株有2株,占比5.6%(2/36),4重耐药菌株有17株,占比47.2%(17/36),3重耐药菌株有10株,占比27.8%(10/36),2重耐药菌株有2株,占比5.6%(2/36),耐1种药物的菌株4株,占比11.1%(4/36)。其中最常见的是4重耐药,具有两种耐药模式:四环素+红霉素+克林霉素+复方新诺明(14株);四环素+红霉素+克林霉素+氯霉素(2株),见表3。

表3 猪链球菌耐药情况

对四环素耐药基因(tet40、tetB、tetE、tetL、tetM、tetO)、大环内酯类耐药基因(mefA、ermA、ermB)、氨基糖苷类耐药基因(acc(6′)-aph(2″)、ant(6)-Ia、ant(9)-Ia、aph(3′)-III)、叶酸通道拮抗剂耐药基(dfrG)、恶唑烷酮类耐药基因(optrA)、氯霉素类耐药基因(cat、FloR、cmlA)进行预测,不同菌株携带耐药基因种类也不同,最常见的是cmlA(31株,86.1%),其次是ermB(30株,83.3%)、tetL(30株,83.3%)、tetE(27株,75%)、tetB(25株,69.4%)、tetM(21株,58.3%)、FloR(20株,55.6%)、tetO(19株,52.8%)和dfrG(19株,52.8%)等。同时结合耐药基因及SNP进化系统发育树分析显示,36株菌株可分为4个进化谱系,其中谱系1包括15株(41.7%)均为ST1型,谱系2中2株为ST25和1株ST2249;谱系3中6株ST1型和2株ST7型;谱系4中9株ST7型和1株ST1711型,见图1。

注:用最大似然法构建进化树,黑色填充表示存在参数。

3 讨 论

猪链球菌是一种人兽共患病病原体,人可通过破损的伤口接触而感染。本研究通过全基因组测序和抗生素敏感性实验,分析了福建省近18年分离到的36株人源猪链球菌的毒力、耐药和分子流行病学特征。血清2型被认为是最致命的血清型,曾在中国造成了两次大规模的人类疫情和大量的猪死亡[7-8]。血清型3、7和9在许多国家也广泛传播。本研究的猪链球菌分离株中,血清型2(97.2%)最常见,与现有报道一致[9]。

猪链球菌的毒力因子与致病力之间的作用机理还未明确,但两者之间存在密切联系。猪链球菌根据毒力基因不同分为强毒株、弱毒株和无毒株[10]。sly、epf、mrp是血清型2菌株的常用毒力指标[1,12],本研究中猪链球菌的毒力基因携带情况,其中以sly+epf+mrp+有15株,占比41.7%,为最主要毒力基因携带型别,表明我省人感染分离株多为强毒株。多位点序列分型(MLST)是通过测定核酸序列来对细菌进行分型的方法,猪链球菌的MLST分型已经有1 000多种。根据报道,在我国主要流行的MLST分型主要为ST1和ST7型,本研究通过全基因组测序并上传到pubMLST网站进行分型,发现福建省近18年分离到的人感染猪链球菌多为ST1型(58.3%),与文献中报道的猪链球菌易感染人主要是血清2型的ST1为主的结论相一致[13]。

2017-2019年中国临床分离到的猪链球菌大多对克林霉素(96.26%)、四环素(92.52%)和红霉素(67.29%)耐药[14-15]。本研究中我们检测了36株猪链球菌对15种抗生素药物的敏感性,所有分离株至少对一类抗生素耐药,其中,36株均对四环素耐药,对红霉素和克林霉素也发现具有较高的耐药率,而对替考拉宁、阿莫西林、左氧氟沙星、青霉素、万古霉素、莫西沙星、利奈唑胺敏感,与其他地区研究结果类似[16]。研究发现福建省的分离株中林可酰胺类、大环内酯类和四环素类耐药基因的携带率较高。抗生素在食品动物养殖过程中不仅用于预防控制和治疗病原菌感染,也常作为生长促进因子,增加肉的产量。据报道,在所有抗生素中,四环素是猪生产中使用最广泛的,很多研究也报道了中国养猪场使用磺胺类、四环素类、氟喹诺酮类、大环内酯类和β类酰胺类抗生素[17-18]。这导致猪链球菌对四环素、红霉素和克林霉素耐药率高,提示应及时调整抗生素治疗策略,合理使用抗生素,避免产生耐药性。而青霉素、万古霉素、利奈唑胺属于人常用药物,一般很少兽用,因此几乎所有的菌株都对这几种抗生素敏感,但近些年也有许多研究发现有携带利奈唑胺耐药基因的菌株其表现对利奈唑胺及氟苯尼考等耐药[19]。

对36株猪链球菌的耐药基因进行了预测,发现福建省的人感染猪链球菌分离株普遍存在耐药基因,且菌株携带耐药基因型与其耐药表型一致。其中氯霉素类、大环内酯类和四环素类耐药基因的携带率较高,这可能与这些抗生素在养殖业中的广泛使用有关,使耐药基因发生选择和扩散。同时通过ICEfinder网站对菌株分析发现本研究中的36株有15株含有整合性接合元件 (Integrative and conjugative element, ICE),还需进一步对该类菌株研究,以防携带这些元件菌株成为耐药性传播的重要载体。

综上所述,本研究揭示了福建省人感染猪链球菌菌株的毒力、耐药和部分基因组特征具有一定的地域性特征。应加强对福建省各地区猪链球菌的监测,加大对相关从业人员的健康教育,防止人感染猪链球菌病的暴发。

利益冲突：无

引用本文格式：梁雪晨,高亚东,李曲文.福建省36株人源猪链球菌分离株病原学特征分析[J].中国人兽共患病学报,2024,40(2):161-165,170. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2024.00.026