膝骨关节炎表观遗传学研究进展

徐斌丰 宋月莹 吴海君 郑程

膝骨关节炎 (knee osteoarthritis，KOA) 是最常见的渐进性关节疾病，临床表现为膝关节的疼痛、僵硬、活动受限等症状，病理表现为关节软骨和软骨下骨的退变，同时也包含关节滑膜、韧带等周围组织的炎性病变，其致病因素复杂，具有较强的遗传性，对患者生活质量影响较大，同时会造成巨大的个人和社会的经济负担[1]。

近年来，全基因组关联分析 (genome-wide association studies，GWAS) 揭示了大量的 KOA 风险位点，目前已发现报道有超过 90 个骨关节炎 (osteoarthritis，OA) 的易感基因位点[2-4]。部分学者发现位点中包括软骨寡聚基质蛋白、软骨黏附素样蛋白和 Ⅺ 型胶原编码基因的变异，说明存在基因改变导致蛋白质错义突变的现象[2]。而主流观点认为，大多数 KOA 的风险位点位于基因组的非蛋白质编码区，并不干预氨基酸序列，故 KOA 的遗传易感性主要与基因表达的调控相关[5]。这种情况与许多疾病相似，说明 KOA 发展过程中存在调控靶基因表达的 DNA 变异[6]。随着膝关节置换术日趋成熟，大量术中留取的 KOA组织细胞 (主要是软骨细胞) 被用于进行等位基因表达不平衡分析，以建立风险位点与靶基因表达之间的联系，进一步揭示 KOA 疾病机制[7-8]。

表观遗传学 (epigenetics) 是研究基因组原始 DNA 序列不变的情况下，基因表达发生遗传变化的一门遗传学分支学科。表观遗传调控的三个主要机制包括 DNA 修饰、组蛋白翻译后修饰和非编码 RNA 调控。这三种生物机制可以活跃在体细胞中，调节染色质的可及性、转录因子与DNA 的结合程度以及基因组的三维结构等，并以细胞分裂的方式传递延续[8]。伴随微阵列分析、下一代测序技术等基因测序技术的成熟，大量 KOA 表观遗传研究已经展开。鉴于此，笔者对 KOA 表观遗传学的研究现状进行综述，以期为后续研究提供新的思路。

一、DNA 甲基化

DNA 甲基化 (DNA methylation) 是指在 DNA 甲基化转移酶的作用下，基因组 CpG 二核苷酸的胞嘧啶 5 号碳位共价键结合一个甲基基团的生物过程。体细胞中有超过 80%的 CpG 被甲基化，而基因启动子中的 CpG 则可能被或不被甲基化。一般来说，基因启动子甲基化与表达抑制有关，而基因体和其它调控区域 (如增强子) 甲基化效果则不太可预测。高达 20% 的 DNA 甲基化受遗传变异的影响，但大多数甲基化是由其它因素引起的，如环境和随机变异[9]。研究发现，DNA 甲基化的概率随着年龄的增长而增加，环境因素可能是重要原因[10]。DNA 甲基化是动态的，甲基分别通过 DNA 甲基转移酶 (DNA methyltransferase，DNMT) 和甲基胞嘧啶双加氧酶 (ten-eleven translocation，TET) 从 DNA 中添加和移除。大量研究表明，DNA 甲基化参与调节 KOA 的发展[5]。

近年来，表观基因组关联分析 (epigenome-wide association studies，EWAS) 通过对比 OA 软骨细胞与正常软骨细胞或骨髓间充质干细胞 (bone mesenchymal stem cells，BMSCs) 分化的软骨细胞之间的甲基化模式差异，揭示了许多 KOA 相关的甲基化位点，其主要涉及骨骼发育和形态发生相关基因 [ 如转化生长因子 β (transforming growth factor-β，TGF-β)、Wnt、同源异型基因 (homeotic genes，HOX)、骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic protein，BMP) ][11-13]，编码细胞外基质蛋白和基质降解酶的基因 [ 包括 Ⅱ 型胶原 α1 链(collagen type Ⅱ alpha 1 chain，COL2A1)、乙酰辅酶 A 羧化酶 α (acetyl-CoA carboxylase alpha，ACA)、基质金属肽酶 13(matrix metallopeptidase 13，MMP13) ]，编码转录因子的基因 [ 如 Y 染色体性别决定区 -盒转录因子 9 (SRY-box transcription factor 9，Sox9) ][14]。Rice 等[15]从手术留取的 OA软骨中获取 DNA 甲基化、基因型和 RNA 测序数据，并与表达数量性状基因座 (expression quantitative trait loci，eQTL)、表观基因组和电子分析相结合。作者对 42 个 OA 风险位点进行研究，在其中 10 个风险位点中鉴定出 24 个与基因型相关的甲基化 CpG，其中胶原 β (1-O) 半乳糖转移酶 2[ collagen beta (1-O) galactosyltransferase 2，COLGALT2 ]、Ⅺ 型胶原蛋白 alpha 2 链 (anti-collagen Ⅺ alpha 2，COL11A2) 和含WW 结构域的 E3 泛素蛋白连接酶 2 (WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2，WWP2) 为关键靶基因。

部分学者着手于 DNA 甲基化对 KOA 病理机制的调控。在骨代谢平衡方面，BMSCs 向成骨细胞系的分化是由 RUNX 家族转录因子 2 (RUNX family transcription factor 2，RUNX2) 和 osterix 诱导，Wnt 和 BMP 通路配体刺激下发生的[16]。成骨细胞 -骨细胞谱系特征性基因 [ 如碱性磷酸酶、硬化蛋白、核因子-kB 受体激活因子配体 (receptor activator of nuclear factor-kB ligand，RANKL)、骨保护素等 ]在 BMSCs 分化过程中倾向于去甲基化和去抑制，研究发现DNMT 抑制剂 5-氮杂-2-脱氧胞苷 (5-Aza-2’-deoxycytidine，AZA) 可促进 BMSCs 的成骨分化[9,17-18]。BMSCs 的增殖分化能力会随着年龄的增长而降低，可能是受部分 DNA 位点甲基化和羟甲基化的影响[19]。破骨细胞前体分化也与 DNA甲基化相关，其中 DNMT3a 能够抑制抗破骨细胞生成基因，DNMT3a 缺乏的破骨前体细胞不能有效分化为破骨细胞[20]，同时 DNMT3a 可以影响成骨细胞系细胞中 RANKL和骨保护蛋白 (osteoprotegerin，OPG) 的表达，间接促进破骨细胞生成[9]。

此外，Sun 等[21]使用 AZA 或者敲除 DNA 甲基转移酶基因后，均发现细胞内 C 末端结合蛋白 (C-terminal binding protein，CtBP) 的过度表达，从而激活下游促炎细胞因子核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白 3 (nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3) 的表达，促进 OA 炎症反应。Shen 等[22]发现 DNMT3b 在 KOA患者和小鼠 KOA 模型的软骨细胞中表达降低，进一步敲除 DNMT3b 基因后发现三羧酸代谢物升高以及线粒体呼吸作用增强，而使 DNMT3b 过表达后则表现出软骨保护作用。4-氨基丁酸转氨酶 (Abat) 能促进线粒体呼吸作用和分解代谢，其过度表达促进半月板失稳定 (destabilization of the medial meniscus，DMM) 模型小鼠的关节软骨降解，抑制 Abat 表达或敲除 Abat 基因均能延缓关节软骨退变和软骨下骨硬化，而 DNMT3b 能抑制 Abat 表达。上述结果表明 DNMT3b-Abat 可能作为 KOA 治疗的靶点[23]。Zhu等[24]发现小鼠与人类 OA 软骨中 DNMT1 和 DNMT3a 高水平能引起过氧化物酶体增殖物激活受体 γ (peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARγ) 启动子的甲基化，抑制 PPARγ 的表达。使用 AZA 抑制 DMM 小鼠中DNMT1 和 DNMT3a 能够逆转 PPARγ 启动子的甲基化，促进 PPARγ 的表达，减少软骨破坏。对于 PPARγ 基因敲除的小鼠来说，AZA 对软骨破坏的抑制作用明显消失，这表明 PPARγ 的去甲基化可能是新的治疗靶点。另一学者发现增强子区域中存在甲基化 CpG 的富集，认为 DNA 甲基化在远处调控区域可能比在近端启动子中更重要[25]。此外，新的研究发现同一膝关节轻度和重度受累软骨之间DNA 甲基化模式有所不同，这表明不同阶段的 KOA 之间可能存在一些潜在的环境差异导致其甲基化模式不同或者不同的甲基化模式导致了不同程度的 OA[26]。

KOA 的 DNA 甲基化研究的开展时间不长，EWAS 完善了 KOA 的 DNA 甲基化模式，而大部分测序集中在关节软骨，软骨下骨、滑膜等周围组织的甲基化模式有待进一步挖掘。结合 eQTL、表观基因组、电子分析等数据分析手段，能将甲基化位点与 KOA 风险位点相结合，挖掘关键靶基因，以供后续机制研究参考。甲基化与 KOA 病理机制的研究刚刚起步，上述研究探讨了 DNMT、TET 通过甲基化或羟甲基化基因启动子从而控制基因表达，进一步调控 KOA 中骨代谢平衡、关节炎症、软骨代谢等病理机制的过程，并推测出 PPARγ 等治疗靶点，但甲基化研究大部分停留在基因启动子部分，关于增强子、基因体部分的甲基化和去甲基化有待研究，而一系列的治疗靶点需要多方面实验和临床的验证。另外，目前也缺乏对 KOA 不同分期的研究，更多是针对 KOA 疾病终末期，而甲基化与 KOA 的因果关系仍需进一步探讨。

二、组蛋白修饰与染色质结构

组蛋白 (histone) 是细胞核中与 DNA 结合存在的碱性蛋白质。组蛋白 N 末端的翻译后修饰 (posttranslational modifications，PTM)，如乙酰化、甲基化，可以重塑染色质的形状，进而改变染色质对参与转录蛋白质的可及性，从而调节基因表达[27]。组蛋白 PTM 同样也是动态的，例如，乙酰基可以通过组蛋白乙酰化酶 (histoneacetyltransferase，HAT) 添加，也可以通过组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC) 移除。

乙酰化和去乙酰化在 KOA 的组蛋白 PTM 研究中占据了主要部分，Ⅰ 类和 Ⅱ 类 HDAC 与软骨发育有关，例如，敲除 HDAC3、HDAC4、HDAC5 等可影响小鼠软骨内骨化[28-29]。HDAC4 能够抑制 OA 患者的软骨细胞中 Runt 相关转录因子 2 (RUNX2) 表达，从而抑制 MMP13 表达[30]。沉默信息调节因子 (silent information regulator，SIRT) 是 Ⅲ类去 HDAC，其中 SIRT1 是维持软骨稳态所必需的[31]，研究发现通过激活线粒体转录因子 A (mitochondrial transcription factor A，TFAM) 介导的丝裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase，AMPK)/ SIRT1/ 过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 共激活因子 1α (peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1α，PCG-1α) 通路逆转软骨细胞中线粒体生物发生、氧化磷酸化和细胞内腺嘌呤核苷三磷酸的损伤，延缓 KOA 进展[32]。另有研究发现 SIRT3 基因敲除的小鼠软骨细胞会出现超氧化物歧化酶 2 (superoxide dismutase 2，SOD2) 相关的线粒体功能障碍导致的氧化应激增加，导致自发性年龄相关性 KOA，而SIRT3 可能通过去乙酰化抑制 SOD2 的活性来缓解软骨细胞的氧化应激反应[33]。

在组蛋白甲基化修饰方面，Monteagudo 等[34]发现DOT1 样组蛋白赖氨酸甲基转移酶 (DOT1 like histone lysine methyltransferase，DOT1L) 可通过抑制 SIRT1 的活性来抑制 Wnt 信号通路，进而调控软骨细胞分化和内环境稳定。DOT1L 基因缺失小鼠的关节软骨中可观察到 Wnt 信号过度激活和异常软骨肥大[35]。组蛋白去甲基化酶 -赖氨酸脱甲基酶 (lysine demethylase，KDM) 4B 通过去除 Sox9 启动子区域中抑制性组蛋白 PTM (组蛋白 3 中赖氨酸 9 的甲基化，H3K9me3) 来介导 Sox9 转录激活，进而促进 TGF-β介导的软骨形成[36]。Dai 等[37]发现 KDM6B 在软骨发育过程中显著表达，且能够与 COL2A1 启动子直接作用来调节COL2A1 的表达。

目前组蛋白 PTM 的研究主要涉及乙酰化与甲基化，泛素化、磷酸化等研究较少；大部分研究聚焦组蛋白修饰与软骨细胞凋亡以及软骨外基质降解的联系，关于细胞炎症等其它机制涉及较少。总的来说，这些研究清楚表明组蛋白修饰在软骨发育、退化和内环境稳定中是必不可少的。基于这些关键作用，组蛋白修饰酶被认为是治疗 KOA的重要靶点[9]。然而值得注意的是，大部分组蛋白修饰酶在其它组织和细胞类型中同样发挥作用[38]。例如，DOT1L不仅调控软骨发生和软骨内稳态[34]，而且在端粒沉默、减数分裂检查点控制和 DNA 损伤反应中起到重要作用[39]，敲除 DOT1L 基因的小鼠就表现出生长障碍、卵黄囊血管生成缺陷和心脏肥大等骨骼肌肉系统外多系统的发育异常[40]，在 SIRT1、KDM6B 等修饰酶的研究中也可见到相似的现象[41-42]。针对组蛋白修饰酶的靶向性治疗很可能会产生其它系统的不可估计的副作用，在临床试验前仍需要全面完善相关的研究。

除了组蛋白 PTM，细胞核中染色质本身的空间组织也可以调控基因表达。通过染色体构象捕获技术可以发现，基因组被分成所谓的拓扑相关结构域 (topologically assocaited domain，TADs)，区域中的基因或蛋白相较于区域外的其它基因有更频繁的自身相互作用，而基因增强子通常与 TADs 中的基因有关[43]。而如转录因子和内聚蛋白介导所形成的“DNA 环”，能够改变染色质结构，使远处的增强子和其对应启动子互相接触[9]。3D 染色质组织在基因表达、组织发育和疾病的调节中具有重要作用，这一过程可能有助于发现骨关节炎的发病机制。目前关于三维染色质结构的研究还很少，没有软骨细胞或成骨细胞的染色质构象捕获数据。

三、非编码 RNA

非编码 RNA 根据长度分为小 RNA (＜ 200 个核苷酸)和长链非编码 RNA (LncRNA，＞ 200 个核苷酸)。最著名的小 RNA 亚群是 microRNA (miRNA，18～25 个核苷酸)。

1.miRNA：在 KOA 进展中，许多 miRNA 与软骨发育或内环境稳定有关[44]。Coutinho de Almeida 等[44]提取来自同一患者肉眼下完好的和受损的共 130 例 OA 软骨样本的 miRNA 和 mRNA 序列数据，而后借助公共 miRNA 靶基因数据库进行筛选，生成了由 62 个差异表达的 miRNA 和238 个差异表达的 mRNA 组成的 OA 特异性 miRNA-mRNA相互作用数据组。

其它研究进一步阐明了骨软骨发育和内环境稳定的关键 miRNAs。研究发现人 OA 软骨和小鼠软骨中 miR 204 水平与年龄及 OA 程度呈正相关，且受多种衰老诱导剂 (红外辐射、H2O2) 诱导上调，其直接抑制软骨蛋白多糖生物合成相关 mRNA 表达，如硫酸软骨素 (chondroitin sulfate，CS) 和透明质酸形成相关的关键基因，从而抑制硫酸化糖胺聚糖的产生。关节内注射 miR-204 模拟物会加剧 DMM 小鼠的软骨损伤，而注射 miR-204 抑制剂能延缓DMM 小鼠 KOA 进展。抑制人软骨细胞中的 miR-204 同样可以上调 CS 水平并抑制 MMP 的表达[45]。Huang 等[46]将42 周龄小鼠 BMSCs 中 miR-204、211 基因双敲除后，发现多关节中 MMP 表达升高，关节软骨破坏，而关节内注射 miR-204 的腺病毒可缓解 DMM 小鼠 KOA 进展。Kang等[47]认为 miR-204 是由核因子 kB (nuclear factor kappa-B，NF-kB) 和 GATA 结合蛋白 4 (GATA binding protein 4，GATA4) 诱导的破坏软骨性 miRNA，其研究发现 miR-204靶向多条硫酸化蛋白聚糖生物合成通路，抑制蛋白聚糖合成代谢，而 DMM 小鼠关节注射抗 miR-204 后软骨破坏明显减少，同时促进蛋白聚糖合成并抑制软骨中炎症衰老相关的分泌表型因子。无论如何，上述研究都说明了miR-204 在维持关节内稳态中的重要作用。

此外，自噬是近期 KOA 中 miRNA 的机制研究较多的方面。自噬使受损的细胞成分被降解和再循环，是维持细胞内稳态的重要手段。在 KOA 中，自噬可以抑制炎症，减少软骨细胞凋亡，而自噬相关基因的异常则增加 OA 的风险[48]。除了 miR-140-5p 和 miR-146a 外，促进软骨细胞自噬的 miRNA 包括 miR-34a-5p、miR-107、miR-335-5p 和miR-let-7e[49-52]。抑制自噬过程的 miRNA 包括 miR-206、miR-375、miR-411 和 miR-449[53-56]。虽然自噬是维持软骨细胞内稳态所必需的，但异常的自噬也会对 KOA 的进展产生影响。

2.LncRNA：LncRNA 能够调节细胞质中 mRNA 的稳定性、翻译和翻译后修饰[57]。Ajekigbe 等[58]运用转录组测序技术 (RNA-seq) 绘制 OA 的 LncRNA 表达特征，发现相较于健康个体，OA 关节软骨中，有近 200 例 LncRNA差异表达。另一研究针对健康和 OA 滑膜测序，揭示17 种差异表达的 LncRNA[59]。研究发现 OA 患者的血浆中 LncRNA HOX 转录反义基因间 RNA (HOX transcript antisense RNA，HOTAIR) 呈高表达，LncRNA p50 相关COX-2 外源 RNA (p50-associated COX-2 extragenic RNA，PACER) 低表达[60]。HOTAIR 可通过抑制 miR-130a-5p 表达来增加细胞凋亡[61]，而 PACER 可通过抑制 HOTAIR 表达来减少软骨细胞凋亡[60]。与非肥胖 OA 患者和健康人相比，肥胖 OA 患者滑膜中可发现 LncRNA-人类肺腺癌转移相关转录本 1 (metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1) 的差异表达，而敲除 KOA 滑膜成纤维细胞中的 MALAT1 可抑制细胞增殖，上调白介素-8表达，促进细胞生长增殖和炎症反应，提示其具有抗凋亡和抗炎作用[62]。

四、总结

表观遗传机制能够调节多种基因的表达，在关节发育形成和维持生理环境稳态方面扮演重要角色[8]。新出现的数据表明，大部分 KOA 的遗传风险位点直接影响或至少涉及表观遗传调节因子。基因测序的门槛和成本正在不断下降，表观基因组学研究的数量将继续增加。目前大部分KOA 机制研究包括 DNA 甲基化、组蛋白 PTM、miRNA、LncRNA 的研究主要在阐明表观遗传因子与 KOA 软骨退变之间的联系，而 KOA 是关节整体疾病，关节滑膜、软骨下骨等组织均扮演重要角色。KOA 表观遗传研究仍需进一步扩大规模和深度，完善如不同分期、不同年龄个体(如幼年、老年)、不同组织 (滑膜、软骨下骨、关节周围韧带等) 的表观遗传数据，与病理机制相结合，找寻新靶点并进行实验和临床验证，为 KOA 治疗寻找新的方向。另外，使用机器学习和人工智能技术来整合基因组、表观遗传学、代谢、蛋白质组学数据，将能够更加全面地了解KOA 的发病机制以及为个体患者进行个性化治疗。