慢加急性肝衰竭动物模型研究现状

刘 韦，白 浪

四川大学华西医院感染性疾病中心，成都 610041

慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是指在慢性肝病基础上，短期内出现肝功能急性失代偿的临床综合征。ACLF 发病机制复杂，病情凶险，进展迅速，伴发多器官功能衰竭，短期病死率高，尚无具体有效的治疗措施［1］。因此建立一个合适的、稳定的并且高度模拟临床的ACLF 动物模型对于阐明ACLF 发病机制具有重要的价值和意义，有助于临床制订更加有效的早期诊断和治疗策略，从而提高临床ACLF 的救治成功率。然而，由于ACLF 病因复杂、并发症众多，其动物模型研发一直存在较大挑战。本文就目前常用的ACLF动物模型建立方法进行综述。

1 ACLF概述

目前ACLF 的定义在国内外尚无统一的标准。我国将ACLF定义为：在慢性肝病基础上，由各种诱因引起的以急性黄疸加深（总胆红素≥10 倍正常值上限或每日上升≥17.1 μmol/L）、凝血功能障碍（凝血酶原活动度≤40%或国际标准化比值≥1.5）为肝衰竭表现的综合征，可合并包括HE、腹水、电解质紊乱、感染、肝肾综合征、肝肺综合征等并发症，以及肝外器官功能衰竭。根据不同慢性肝病基础分为3型，A 型：在慢性非肝硬化肝病基础上发生的慢加急性肝衰竭；B型：在代偿期肝硬化基础上发生的慢加急性肝衰竭，通常在4 周内发生；C 型：在失代偿期肝硬化基础上发生的慢加急性肝衰竭［2］。目前ACLF 的发病机制尚未完全阐明，可能与易患体质、诱发因素、炎症反应、器官衰竭等有关［3］。常见的危险因素主要有细菌感染、酒精、静脉曲张破裂出血、肝毒性药物、肥胖和血脂异常等。ACLF 尚缺乏具体有效的治疗方案，主要依赖于药物治疗、人工肝支持治疗以及肝移植等［1，4］。

2 建立ACLF动物模型方法

目前建立ACLF 动物模型的思路均是通过各种方法先诱导实验动物肝脏的慢性损伤，然后在慢性损伤的基础上，进一步实施急性攻击，从而导致肝脏发生急性肝衰竭。

目前在诱导肝脏慢性损伤阶段采用的方法不同，主要有CCl4注射、硫代乙酰胺注射、血清白蛋白注射以及胆管结扎等方法。在急性攻击阶段，可采用不同急性攻击方式，包括单用CCl4或D-氨基半乳糖胺（D-Gal Nactosamine，D-GaL N）LPS 联合D-GaL N 等方法。Hassan 等［5］对目前所建立ACLF 动物模型的方法进行了较全面的总结，本文主要对CCl4法、硫代乙酰胺法、血清白蛋白法以及胆管结扎法4种常用的方法进行总结、对比及思考。

ACLF 动物模型首选啮齿类动物，尤其是老鼠，由于体型小，寿命短，妊娠期短，容易在圈养环境中饲养和繁殖，而且与人类在基因上的显著相似性，加上基因操纵的便利性，因此老鼠成为目前模拟ACLF 的最常用的实验动物［6］。另外，建立大型动物模型可选择猪、兔、非人灵长类动物等，其中非人灵长类动物如猴、猩猩、狒狒等与人类十分相似，但其价格和造模的方法更为严格，导致其很难大规模开展，因此少有研究者以此建立ACLF动物模型。

2.1 CCl4联合LPS/D-Gal N法 CCl4是一种能引起肝细胞坏死的化合物，常作为诱发各种肝损伤的造模剂［7］。CCl4通过肝细胞的细胞色素P450的激活，生成自由基物质CCl3·和CCl3OO·，这些自由基会对膜结构上的多不饱和脂肪酸产生攻击，促使细胞膜、线粒体膜等生物膜发生脂质过氧化，从而导致脂质过氧化物的产生，后者反过来还能对各种生物膜造成进一步的损伤，使其稳定性和完整性降低、通透性增加，造成细胞内各种酶的溢出以及其他细胞损伤，最终导致肝细胞的凋亡与坏死［8］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）又称内毒素，是革兰阴性菌细胞壁表面的一种成分，通过刺激免疫细胞释放炎症因子，导致肝细胞发生凋亡与坏死［9］。D-Gal N可通过抑制mRNA合成和部分抑制糖复合物的转移后修饰导致肝细胞损伤，同时激活巨噬细胞和粒细胞，促进炎症反应的发生，从而导致肝细胞凋亡。而毒性剂量的D-Gal N 主要是通过耗竭ATP、抑制大分子合成导致肝细胞坏死。在LPS 和D-Gal N 的协同作用下，实验动物的肝细胞在短时间内大量死亡，肝脏生理功能严重受损［8］。

CCl4联合LPS/D-GaL N诱导的ACLF动物模型，可用于模拟人类化学毒性物质所致的肝损伤，是目前比较常用的方法，该方法常采用腹腔内注射作为给药方式，一方面操作简便，便于掌握注射剂量，一方面药物吸收较皮下注射快避免局部皮肤产生炎症，而较血管注射慢避免导致急性药物中毒。但研究者们在实验动物选择、诱导方式、诱导剂量等方面存在一定的差异。

目前CCl4联合LPS/D-GaL N 建立的ACLF 动物模型可分为大鼠模型和小鼠模型。目前多数研究已经证实，在诱导肝脏慢性损伤阶段，无论是选择大鼠或者小鼠建模，12周左右的建模时间可以导致大鼠或者小鼠的肝脏发生明显的慢性损伤。在12周的造模过程中，为使肝功能维持损伤状态并防止其完全恢复，同时又不会因为给药频繁，剂量过大导致其死亡，最合适的给药频率建议为2次/周［10］。根据用于建模的鼠的种类不同，CCl4的注射剂量有所不同。张慧芸等［11］将3～4周龄BALB/C的雄性小鼠腹腔注射20% CCl4油溶液5 mL/kg；高安等［12］将3～4周龄的SPF级雄性C57BL/6小鼠作为实验动物，腹腔注射20% CCl4（橄榄油稀释）5 mL/kg，2次/周，共12周。而诱导大鼠慢性肝损伤步骤相对繁琐，研究［13-14］发现若选择雄性SD大鼠（体质量160～170 g），虽然同样是通过腹腔注射50% CCl4植物油溶液，连续12 周，每3 天1 次，但是和小鼠不同，剂量需要做相应的调整，其中第1个月剂量为1.5 mL/kg，第2、3 个月剂量为2.0 mL/kg。另外，为防止大鼠对CCl4产生耐药性，需在4周后加大剂量，通常加至起始剂量的0.3 倍左右，而诱导小鼠肝硬化的给药剂量相对稳定。

在急性攻击阶段，可采用不同急性攻击方式，分为单用CCl4或D-GaL N、LPS 联合D-GaL N 三种方法，张海燕等［13］模拟了以上三种急性攻击方法，以比较不同的方法是否能成功诱导慢性肝损伤基础上急性肝衰竭的发生，在成功诱导大鼠慢性肝损伤后，将实验大鼠分为A、B、C三组，实验组A：2 g/kg D-Gal N；实验组B：100 μg/kg LPS联合0.5 g/kg D-Gal N；实验组C：5 mL/kg 50% CCl4植物油溶液，给药途径均为腹腔注射。结果显示三组实验大鼠肝脏均出现肝细胞大块或亚大块坏死，符合急性肝衰竭表现，其中实验组B肝细胞坏死程度大于A、C组，C组最轻。该研究表明三种方法均可成功诱导肝硬化基础上的急性肝衰竭。其中单独D-Gal N注射诱导生存时间最长提示该模型有较长的治疗窗，更适合药物筛选的实验研究，而单独CCl4注射诱导的急性肝衰竭的发生虽然也迅速，但其肝细胞坏死程度不如LPS 联合D-Gal N 诱导的急性肝衰竭明显。LPS 联合D-Gal N 诱导的急性肝衰竭发生时间快、肝细胞坏死程度最为严重，因此相对于其他两种处理方式，LPS联合D-Gal N诱导在慢性肝损伤基础上的急性肝衰竭发生，可能更适合ACLF病理机制的实验研究。但是不同的研究也会采用不同的LPS 和D-Gal N剂量诱导急性肝衰竭发生。张慧芸等［11］在12周末次给药3 d后腹腔联合注射D-Gal N 1 g/kg、LPS 10 μg/kg建立ACLF 小鼠模型。高安等［12］在12 周末次给药10 d后，给予一次性腹腔联合注射（LPS 0.5 mg/kg、D-Gal N 400 mg/kg），建立ACLF 小鼠模型。可见，在使用LPS 联合D-GaL N急性攻击方式时，研究者们在LPS和D-GaL N的剂量选择上存在差异，考虑到LPS的毒性作用较强，因此急性攻击时所需LPS的剂量通常都远远小于D-GaL N，但是联合这两种药物进行急性攻击时，其最优剂量还值得进一步探索。

综上，多种研究证明CCl4联合LPS/D-Gal N 法建立ACLF 动物模型简单易行、稳定性好，适用于多种临床研究。但有研究［15］表明CCl4模型在诱导因素停止后，肝纤维化程度、炎症等逐渐减轻。特别是有学者［16］认为细菌感染在ACLF患者中极为常见，急性细菌感染是亚洲ACLF最常见的诱发事件之一，通常与全身炎症、不良的临床结局和高病死率密切相关［17］。而仅仅通过CCl4或者D-Gal N 等药物注射并没有很好的模拟感染在肝衰竭发生中的作用以及肝外器官的损害。因此CCl4联合LPS/D-Gal N 法在模拟ACLF 的进展过程中仍然存在局限和不足。近年来有研究建立了更加完整模拟ACLF 病程及临床特征的ACLF 小鼠模型，所采用的方法分为诱导慢性肝损伤、急性肝损伤、细菌感染三个阶段，具体如下：首先将雄性C57BL/6J 小鼠腹腔内注射CCl4（0.2 mL/kg），每周2 次，持续8 周，以诱导小鼠慢性肝损伤；在急性攻击阶段，再次注射双倍剂量的CCl4（0.4 mL/kg），然后腹腔注射克雷伯氏菌肺炎菌株或行盲肠结扎穿刺术［18］。该方法通过诱导细菌感染成功构建了一种严重肝损伤的ACLF小鼠模型，更佳地模拟了ACLF的临床核心病程以及病程中易出现的肝外脏器损伤。该模型不仅具有合适的生存周期用于干预研究。同时，该模型造模方法能够很好地标准化，取材容易，简便快速，易于推广，为ACLF 的相关机制研究和新治疗靶点筛选提供了可靠的平台。

2.2 硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）联合LPS 法 TAA是一种肝毒性药物，被人体摄取后，可经肝细胞内细胞色素P450 混合功能氧化酶代谢为TAA-硫氧化物，后者进一步代谢为中间代谢产物及其他极性分子，并与肝脏大分子物质结合，引起肝细胞功能的改变继而坏死。一次性腹腔注射TAA 可导致急性肝炎，反复腹腔注射可导致肝细胞坏死、再生结节形成、毛细胆管增生、门静脉高压而导致肝硬化［19］。TAA 诱导慢性肝损伤的机制是影响蛋白合成及肝细胞中酶的代谢，在组织学和生化代谢的变化上与各种病因引起的人类肝硬化改变很相似，诱导所产生的肝纤维化更为稳定和持久［20］。

de Mesquita 等［21］在TAA 注射前约1 h，将其溶解于0.9%生理盐水中，给予雄性Wistar大鼠腹腔注射200 mg/kg TAA，每周2次，持续12周，用于建立慢性肝病动物模型。Tripathi 等［22］将雄性大鼠（150～200 g）腹腔注射生理盐水溶解的TAA，剂量为250 mg/kg，2 次/周，持续10 周，建立无腹水发生的慢性肝病大鼠模型，再给予代偿期的大鼠腹膜内或静脉内注射LPS（1 mg/kg），以建立ACLF 大鼠模型。

TAA 诱导的TAA 动物模型也可用于模拟人类化学毒性物质所致的肝损伤，与CCl4模型相比，其诱导的肝损伤稳定性更好更持久，不易逆转。但由于TAA 的毒性较强，对人体危害性较大，不利于研究者操作，因此目前不常用于建立ACLF动物模型。

2.3 血清白蛋白法 Bhunchet 等［23］研究认为，当机体反复接受异体血清时，会导致体内大量生产的免疫复合物，从而促使血管内皮细胞、Kupffer 细胞产生大量细胞因子，作用于肝贮脂细胞，最终导致肝纤维化。目前主要通过牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、人血清白蛋白（human albumin serum，HSA）、猪血清（porcine serum，PS）诱导免疫损伤性肝损伤模型，在此基础上再进一步联合使用D-Gal N、LPS 以建立ACLF 动物模型。该方法通常选择大鼠作为实验动物，不同研究应用血清白蛋白法建立ACLF 模型的区别主要在于白蛋白的种类，给药剂量，给药途径以及给药时间不同。

目前常用的血清白蛋白包括BSA、HSA 和PS。我国刘旭华等［24］首先利用HSA 联合D-GalN/LPS 建立大鼠ACLF 模型。BSA 和HSA 诱导肝脏慢性损伤通常分为两个阶段，一是免疫阶段，血清白蛋白用生理盐水稀释与等体积的完全福氏佐剂乳化，每次皮下注射0.5 mL（内含白蛋白4 mg），共4次（第1、15、25、35天）。二是免疫攻击阶段，即静脉注射血清白蛋白。刘子倩等［25］将SPF 级雄性大鼠皮下多点注射含4 mg的BSA乳化液0.5 mL，分别于第1、15、25、35 天时皮下多点注射致敏（共4 次）；再向大鼠尾静脉注射BSA 溶液，每周2 次，共计6 周（12 次），BSA含量从每次2 mg开始，每次增加0.5 mg注射，逐次增加至每次4 mg 后维持此剂量。刘旭华等［23］给予雌性Wistar大鼠皮下注射4次0.5 mL的HSA乳化液后，向大鼠尾静脉注射2.5 mg的HSA，逐次增加0.5 mg直至4.5 mg，并维持次剂量，每周2次，共6周。Wang等［26］给予Wistar雄性大鼠皮下多点注射4 次含有4 mg 的HSA 乳化液0.5mL。HSA 致敏后，向大鼠尾静脉注射4 mg HSA，每周2 次，持续6 周，导致大鼠肝脏慢性损伤。BSA 或者HSA 法的主要区别在于致敏后静脉注射白蛋白的剂量，HSA法既可采用2.5 mg起始，逐次增加0.5 mg，至4.5 mg后维持该剂量，也可直接采用维持剂量4 mg，而BSA法则多选择从2 mg起始，逐次增加0.5 mg，至4 mg后维持该剂量。采用逐次递增剂量的方式可能使大鼠的死亡率降低，提高建模成功率，但对于更好地模拟人类ACLF而言，两者孰优孰劣需要进一步探索。相对于BSA或者HSA诱导肝脏慢性损伤相对繁琐的步骤，Li 等［27］给予雄性Wistar 大鼠腹腔注射0.5 mL 的PS，每周2 次，持续11 周，建立肝纤维化模型。PS诱导肝脏慢性损伤则更为简便，利于操作，可重复，同时PS 法所选择的给药途径为腹腔注射，相对于皮下注射、静脉注射更为安全，成模率高。

在急性攻击阶段，BSA 法、HSA 法和PS 法均采用联合使用D-Gal N、LPS 的方式，但是由于诱导慢性肝损伤的白蛋白种类不同，D-Gal N、LPS 的给药剂量、给药途径存在差异。其中，BSA 法、HSA 法可采用相同的急性攻击方式，在大鼠慢性肝损伤的基础上，于第6 周末，联合给予腹腔注射100 μg/kg 的LPS 和400 mg/kg 的D-Gal N以诱导急性肝衰竭［24-26］。而通过PS 诱导的大鼠，将于11 周后给予其静脉注射剂量为50 μg/kg 的LPS，30 min后再腹腔注射剂量为600 mg/kg 的D-Gal N 以诱导急性肝衰竭［27］。

综上，BSA 法、HSA 法和PS 法均可成功建立ACLF大鼠模型。目前利用免疫诱导法建立ACLF动物模型的常见造模方式，是HSA 法建立的ACLF 大鼠模型［28］，但其建立的模型死亡率相对较高，为23%［29］。与BSA 和HSA 法建立的ACLF 大鼠模型相比，PS 模型的死亡率更低，更容易操作，同时该模型与人类ACLF更加相似［27］。

2.4 胆管结扎术（bile duct ligation，BDL）法 BDL通过结扎胆管使胆汁反流造成肝细胞损伤来诱导肝纤维化。BDL诱导后的大鼠对内毒素敏感性增加，通常使用D-Gal N或LPS使大鼠发生急性肝损伤。

丛伟［30］通过此方法成功建立了ACLF 大鼠模型，首先将雄性SD 大鼠（体质量250～280 g），术前禁食12 h，结扎胆总管，4 周后可建立胆汁淤积性肝硬化模型。然后取胆管结扎4 周后存活的大鼠（已建立胆汁淤积性肝硬化模型），禁食12 h，按1.4 g/kg 给药剂量配置D-Gal N（配置浓度0.2～0.4 g/mL），腹腔注射24 h 后可诱导肝硬化基础上的急性肝损伤。

Tripathi 等［22］使用BDL 建立ACLF 动物模型，首先结扎雄性大鼠（200～225 g）胆总管，诱导继发性胆汁性肝硬化（共28 天）。在血流动力学研究前4 h，给予肝硬化失代偿期的大鼠腹膜内或静脉内注射1 mg/kg的LPS，以建立ACLF大鼠模型。

BDL 模型可用于模拟人类胆管阻塞而造成的肝损伤，但BDL模型手术复杂，模型较不稳定。

3 建立ACLF动物模型的挑战与展望

综上所述，CCl4联合LPS/D-Gal N 法、TAA 联合LPS法、血清白蛋白法、胆管结扎术法是目前建立ACLF 动物模型常用的方法，CCl4模型、TAA模型均为化学毒物的损伤，操作简单便利，但对于剂量的选择有一定要求，剂量过大易导致动物死亡，过小则达不到诊断要求。血清蛋白法主要模拟免疫性的肝损伤，模型稳定，可重复。BDL法模拟人类胆管阻塞而造成的肝损伤操作复杂，对动物损伤大，较不稳定。可见，建立ACLF 动物模型有多种方法，研究者可以根据具体研究目的选择一种合适的方法。但ACLF 的病因、病理机制复杂多样，同时实验动物与人类之间存在异质性，而临床情况更加复杂，将同时或依次出现多种诱发因素和并发症，导致多种疾病和器官衰竭，因此无法准确地模拟人类ACLF发生发展过程［31］。

ACLF发生于慢性肝病的基础上，通常包括病毒性肝病、酒精性肝病、药物性肝病、自身免疫性肝病等，其病因多种多样，不同病因所致的肝损伤机制各有不同。HBV的再激活是亚洲地区ACLF 的主要原因，其患病率高，HBV 相关的急性慢性肝衰竭占ACLF 的70%以上［32-34］。但是目前所建立的ACLF 动物模型，包括可模拟化学毒物性损伤、免疫性肝损伤、胆汁淤积性肝损伤，均无法模拟病毒性肝损伤，因此建立HBV相关的急性慢性肝衰竭动物模型是目前的一大难题和挑战。另外，为建立合适的ACLF动物模型，实验动物的选择也很重要，根据不同的研究目的，选择最适合的动物模型，考虑到啮齿类动物的优势，目前通常选择大鼠或者小鼠作为实验动物。

理想的ACLF 动物模型应尽量模拟人类的肝损伤发病机制，虽然此过程可通过使用不同药物、毒物或其他有创操作而实现，也可调整给药剂量或其他方式尽可能模拟人类ACLF的死亡率、生存率，但目前由于动物本身与人类之间存在异质性以及外界因素的不可控性，暂时无法完整复制人类ACLF。因此选择更符合人类发病机制的动物、更佳的毒物药物、合适的药物剂量等，需要研究者们进一步探索。

利益冲突声明：本文不存在任何利益冲突。

作者贡献声明：刘韦起草论文；白浪负责拟定写作思路，论文审阅修改。