伊枯草菌素抑菌稳定性及对雪梨采后保鲜的影响

米婧璇,张飞燕,孟祥荷,王雅娜,王一凡,刘洪伟,赵山山,张丽萍

(1.河北工程大学,河北 邯郸 056000;2.河北省科学院生物研究所,河北 石家庄 050081; 3.河北省人民医院,河北 石家庄 050057)

0 引言

伊枯草菌素是芽孢杆菌产生的一种脂肽类化合物,具有广谱的抗真菌活性[1],研究发现伊枯草菌素对西瓜枯萎病菌(Fssartmoxysporum)、草莓腐败菌镰刀霉(Fusariumfujikuroi)、玉米叶斑病原菌(Southcornleafblight)等多种病原真菌具有抑制作用[1-3]。

梨黑斑病是梨的三大病害之一,由梨链格孢菌(AlternariaNees)侵染引起[4],受感染的果实发生严重的腐烂变质,造成巨大的经济损失。目前防治该病以化学农药为主,长期大量使用易造成果品农药残留、环境水体污染等问题,严重危害人体健康。生物制剂具有安全、高效、环境友好等特性,研发新型生物农药,是实现国家绿色发展战略、农业可持续发展的重大需求。

本项目组前期研究发现贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101(Bacillus velezensis ZLP-101)所产伊枯草菌素对多种植物病原真菌有较强的抑制作用,本文在探讨伊枯草菌素对梨链格孢菌抑菌稳定性的基础上,研究其对采后雪梨贮存品质的影响,为其进一步开发梨果保鲜剂及新型生物农药提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料及来源

伊枯草菌素由河北省科学院生物研究所微生物研究室分离纯化自贝莱斯芽孢杆菌ZLP-101,梨链格孢菌由河北省科学院生物研究所微生物研究室保存,雪梨采摘于石家庄赵县雪梨种植基地。

培养基:PDA固体培养基。

1.2 包埋法制备含菌平板

将梨链格孢霉菌在PDA培养基上进行培养,用无菌水冲洗下菌落上的分生孢子,将孢子悬浮液浓度调整为1×106cfu/mL,参考曾维才[5]的方法,制备含菌平板备用。

1.3 伊枯草菌素的抑菌活性及稳定性分析

1.3.1 伊枯草菌素抑菌活性测定

采用平板对峙法测定伊枯草菌素抑菌活性,在1.2制备好的含菌平板上打孔,将伊枯草菌素稀释成浓度为1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL、6 mg/mL、7 mg/mL、8 mg/mL的溶液,分别注入孔内,48 h后测量抑菌圈直径,每组设3个平行。

1.3.2 pH值对伊枯草菌素抑菌活性的影响

量取浓度为2 mg/mL伊枯草菌素溶液1 mL,用1 mol/ L的HCl 溶液和1 mol/ L的NaOH溶液分别调节pH值分别至 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0,处理1 h后将pH调至7.0,测定其抑菌活性。

1.3.3 温度对伊枯草菌素抑菌活性的影响

量取浓度为2 mg/mL伊枯草菌素溶液1 mL,分别在20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃下水浴30 min、60 min后晾至室温,测定其抑菌活性。

1.3.4 反复冻融对伊枯草菌素抑菌活性的影响

量取浓度为2 mg/mL伊枯草菌素溶液1 mL,在-20 ℃和-80 ℃条件下反复冻融2、4、6、8、10次,随后放至室温,测定其抑菌活性。

1.3.5 金属盐离子对伊枯草菌素抑菌活性的影响

量取浓度为2 mg/mL伊枯草菌素溶液1 mL,分别添加1 mL浓度为1 mg/mL的MnSO4、K2SO4、CuSO4、MgSO4、Na2SO4、Fe2(SO4)3,常温条件下处理1 h,测定其抑菌活性。

1.3.6 紫外线照射对伊枯草菌素抑菌活性的影响

量取浓度为2 mg/mL伊枯草菌素溶液1 mL,于30 W紫外灯下,分别照射2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h,测定其抑菌活性。

1.3.7 贮藏时间对伊枯草菌素抑菌活性的影响

量取浓度为2 mg/mL伊枯草菌素溶液1 mL,在室温条件下保存7 d、14 d、21 d、28 d,测定其抑菌活性。

1.4 伊枯草菌素溶液对雪梨保鲜效果研究

挑选无机械损伤、成熟度基本一致的新鲜雪梨用蒸馏水冲洗干净,在室温下风干1 h,随机分为4组,每组5个。对照组为空白处理;处理组1参考祖雪[6]的离体接种试验,用接种针对雪梨表面轻刺造成3个微刺伤口,在伤口上接种5 μL梨链格菌孢子悬浮液;处理组2置于2 mg/mL的伊枯草菌素溶液中浸泡30 min;处理组3接种梨链格孢菌24 h后置于2 mg/mL的伊枯草菌素溶液中浸泡30 min。均在室温下风干,装入保鲜袋,在温度为28 ℃,相对湿度约90%条件下进行贮藏。于第0、7、14、28 d进行发病率及品质指标的测定。方法如下:

发病率:发病率=(发病病斑数/总病斑数)×100%;

失重率:失重率=[(初始重量-贮藏结束重量)/初始重量]×100% ;

硬度:采用GY-4型数显水果硬度计[7]测定;

可滴定酸:参考李涵等[8]的方法进行测定;

还原糖:采用3,5-二硝基水杨酸法[9]测定。

1.5 数据处理与分析

实验数据采用SPSS 20软件进行分析,采用t检验进行差异显著性分析,当P<0.05差异达统计学意义。

2 结果与分析

2.1 伊枯草菌素的抑菌稳定性分析

2.1.1 伊枯草菌素抑菌活性测定

实验结果如图1所示,随着伊枯草菌素溶液浓度增加,抑菌效果逐渐增强;浓度为2 mg/mL时,抑菌圈直径为14.22 mm;浓度为4 mg/mL时,抑菌圈直径为16.18 mm;浓度大于4 mg/mL时抑菌圈直径不再增大。综合考虑伊枯草菌素的抑菌效果与使用成本,采用2 mg/mL作为后续实验浓度。

图1 伊枯草菌素抑菌能力测定结果图

2.1.2 pH值对伊枯草菌素抑菌活性的影响

实验结果如图2所示,在pH 4～7时,随着pH值增大伊枯草菌素抑菌活性逐渐增加;在pH 7～10时,抑菌活性与对照组相比差异不显著;pH大于10后抑菌活性逐渐降低,可见伊枯草菌素在pH 7～10时性能稳定。

图2 pH值对伊枯草菌素抑菌效果的影响

2.1.3 温度对伊枯草菌素抑菌活性的影响

由图3可知,处理温度为40 ℃时,伊枯草菌素的抑菌活性较对照组无明显变化,之后随着处理温度的升高抑菌活性逐渐降低,60 ℃时处理30 min和60 min抑菌活性分别降低为对照组的72.64%和70.32%,表明伊枯草菌素在40 ℃以下性能稳定。

图3 温度对伊枯草菌素抑菌效果的影响

2.1.4 反复冻融对伊枯草菌素抑菌活性的影响

由图4可知,与对照组相比,在-20 ℃和-80 ℃条件下冻融次数低于6次时抑菌圈直径差异不显著,冻融10次时抑菌活性分别降低为对照组的85.86%和85.16%,表明伊枯草菌素具有反复冻融稳定性。

图4 反复冻融对伊枯草菌素抑菌效果的影响

2.1.5 金属离子对伊枯草菌素抑菌活性的影响

实验结果如图5所示,添加1 mg/mL的 Na+、Fe3+可以显著提高伊枯草菌素的抑菌活性,较对照组分别提高了14.77%和17.93%;添加1 mg/mL 的K+、Cu2+、Mg2+显著降低其抑菌活性,分别为对照组的77.21%、77.57%和83.54%,添加Mn+对伊枯草菌素的抑菌活性影响不显著。

图5 金属离子对伊枯草菌素抑菌效果的影响

2.1.6 紫外线照射对伊枯草菌素抑菌活性的影响

实验结果如图6所示,紫外线照射6 h内抑菌圈直径差异不显著,之后随着照射时间的延长活性逐渐下降,8 h抑菌活性降低为对照组的80.87%,可见紫外线照射6 h内伊枯草菌素抑菌性能稳定。

图6 紫外线照射对伊枯草菌素抑菌效果的影响

2.1.7 贮存时间对伊枯草菌素抑菌活性的影响

实验结果如图7所示,与对照组相比,常温贮存14 d内伊枯草菌素抑菌活性无显著差异,贮存28 d时抑菌活性为对照组的91.35%,表明伊枯草菌素具有室温贮存稳定性。

图7 贮存时间对伊枯草菌素抑菌效果的影响

2.2 伊枯草菌素对雪梨保鲜效果的影响

2.2.1 对梨黑斑病的防病效果

由表1室内离体防病实验结果可知,只接种病原菌的处理、贮存28 d后发病率达为100%,处理3发病率为40%,差异显著,表明伊枯草菌素对离体接种的梨链格孢菌有显著的抑制作用。

表1 不同处理的雪梨发病率

2.2.2 失重率

水果贮存过程中,呼吸强度逐渐增强,会加速果实水分流失。不同处理对雪梨失重率变化的影响结果如图8所示,随着储存时间延长,各组样品失重率逐渐增加,其中只接种病原菌的处理1失重率最大,28 d时处理2是对照组的46.3%,可见伊枯草菌素处理能显著降低采后梨果的失重率。

图8 失重率变化

2.2.3 硬度变化

硬度能够直接反映出果品的成熟度和腐烂程度,是判断果蔬品质较直观的依据之一,不同处理对雪梨硬度的影响结果如图9所示,随着贮存时间延长,各处理组样品硬度逐渐降低,其中处理1硬度降低最多;28 d时处理2硬度较对照组高18.7%;可见伊枯草菌素处理能有效保持采后梨果的硬度。

图9 硬度变化

2.2.4 可滴定酸含量变化

可滴定酸是果实品质的重要性状之一,影响果实风味,不同处理对雪梨可滴定酸含量的影响结果如图10所示,随着贮存时间的延长,各处理组样品可滴定酸含量逐渐降低,处理1可滴定酸含量降低最多;28 d时处理2可滴定酸含量较对照组高14.3%,表明伊枯草菌素处理能较好的维持梨果中的可滴定酸含量从而保持其风味。

图10 可滴定酸含量变化

2.2.5 还原糖含量变化

还原糖含量可直接反映果蔬的成熟度,是果蔬甜味的主要来源,不同处理对雪梨还原糖含量变化的影响结果如图11所示,在整个贮存过程中,处理2还原糖含量较为稳定。推测经过伊枯草菌素处理能使梨果呼吸作用降低从而减少还原糖消耗。

图11 还原糖含量变化

3 结论

伊枯草菌素对引起梨黑斑病的链格孢菌有较强的抑菌活性,在pH 7～10、温度40 ℃以下、反复冻融6次、紫外线照射6 h及室温贮存28 d的条件下可保持稳定的抑菌活性,并且添加金属离子Na+和Fe3+能够增强其抑菌活性。采用伊枯草菌素溶液处理采后雪梨,在有效防止病原菌侵染的同时能较好地保持果实硬度,保留果实水分和营养成分,从而延长采后雪梨的保鲜时间。因此,伊枯草菌素具有替代化学保鲜剂的潜力,可作为新型生物保鲜剂进行深入研究。