电化学发光在真菌毒素检测中的研究进展

王 丹，杨武英，王文君

（江西农业大学食品科学与工程学院，江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西 南昌 330045）

真菌毒素是由真菌产生的有毒次级代谢产物，目前已发现400余种，常见的有黄曲霉毒素（aflatoxins，AF）、赭曲霉毒素（ochratoxins，OT）、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）和玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）等[1]。真菌毒素对动物和人体有强烈的急、慢性毒性，例如，痕量的AFB1即有明显的肝毒性和致癌性，属于I类致癌物[2]。真菌毒素的检测方法主要有色谱、质谱及二者联用，酶联免疫吸附法，免疫层析，荧光分析和电化学传感等[3-5]，较为多元化，每种方法有各自的优势和劣势，互为补充。例如，色谱-质谱联用技术检测准确度高，但是在设备普及度、检测速度和样品前处理等方面不具备优势[3]，一般作为确证方法；免疫分析类方法检测准确度不及色谱-质谱法，但在设备普及度、检测速度和样品前处理等方面展现出巨大优势[3-5]，适合于大量样本的快速筛查。

电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）现象在20世纪20年代被发现，受限于科研条件，直到20世纪60年代，才由Bard团队建立了初步的理论体系[6]。自此，ECL的理论基础和应用研究快速展开，特别是进入21世纪后，研究势头迅猛。截至2023年1月，在Web of Science上以“electrogenerated chemiluminescence”联合（或者）“electrochemiluminescence”为主题搜索，共检索到10639 条文献条目，从2002年开始，相关研究报道数量逐年递增（图1）。ECL已在体外诊断领域商业化应用20余年[7]，在食品安全领域的研究尚处于起步阶段。

图1 与ECL有关的出版物数量与年份之间的关系Fig.1 Number of literature related to ECL between 1967 and 2022

ECL是一种由电化学反应驱动的化学发光，与传统化学发光（chemiluminescence，CL）和光致发光（photoluminescence，PL）的区别在于发光体发光所吸收的能量来源不同[8]。CL是发光体吸收化学反应（通常为氧化还原）释放的能量，完成从基态到激发态的跃迁后发光，缺点在于随着化学反应的持续，发光体被快速消耗，因此发光不稳定，表现为间断的闪烁型发光[9]；PL是发光体从外加光源中吸收能量，实现从基态到激发态的跃迁后发光，包括磷光和荧光，缺点在于有些发光体存在光致漂白效应，且激发光对测试信号有干扰[8]。ECL是通过在工作电极表面施加一定电位，发光体在电极表面经氧化还原生成高反应活性物种，进而跃迁至激发态，在返回基态过程中发光。当停止施加电位后，发光即停止，因此，ECL过程易于控制[8,10]。与CL相比，ECL中发光体基本不被消耗，光信号强而稳定，且发光时间较长，便于测定。与PL相比，ECL信号的采集不受外加光源干扰。

随着现代食品安全的发展，各国对真菌毒素的检测标准越发严格，常规检测方法在灵敏度、检测速度等方面的不足逐渐显现。鉴于ECL的技术优势，深入开展其在食品安全检测中的理论及应用研究具有非常重要的意义。本文重点围绕ECL在真菌毒素检测中的应用研究展开综述，并总结ECL在食品安全检测中存在的主要问题和对策。

1 ECL机制

1.1 湮灭型ECL

湮灭途径是指在电极表面施加一定的氧化还原电位，发光体被分别氧化和还原为自由基阳离子和自由基阴离子，这些自由基在电极表面相遇后发生电荷转移，生成激发态后发光（图2）[7,11-12]。该途径产生的自由基阳离子和阴离子需要维持一定的时间，才能在电极表面相遇并完成电荷转移过程[11]，因此，湮灭型ECL主要在无氧的非质子溶剂中进行，对需要在水相中完成的检测体系而言，效率较低[7]。

图2 ECL自由基湮灭途径原理示意图[11]Fig.2 Schematic illustration of ECL annihilation pathways of free radicals[11]

1.2 共反应剂型ECL

阳极ECL

阴极ECL

共反应剂途径的优势在于，发光体和共反应剂的氧化或还原同步进行，两者的氧化或还原产物可即时发生反应生成激发态，克服了湮灭型ECL在水相中效率低下的问题，为ECL在生物分析中的应用提供了必要条件[14-15]。

2 ECL体系组成

2.1 发光体

发光体是ECL的核心元件，按照物质形态不同，主要包括有机物分子、金属配合物和纳米材料[12,16]。有机分子发光体主要有酰肼类和多环芳烃类化合物。酰肼类发光体以鲁米诺（luminol，Lum）及其衍生物为代表，其ECL过程与活性氧相关[16]。多环芳烃类，如9,10-二苯基蒽（9,10-diphenylanthracene，DPA）、红荧烯（rubrene，RUB）和3,4,9,10-苝四甲酸二酐（3,4,9,10-perylenetetracarboxylic acid，PTCA），是常用的有机分子发光体[7,11,16]。金属配合物类研究较多的是铂族金属配合物，如钌（Ru）、铱（Ir）、铂（Pt）和锇（Os）配合物[16]，其中Ru配合物应用最为广泛，如商业化应用20余年的。此外，Ir配合物具有较好的光谱可调性，也受到广泛关注[16]。

2002年，Bard团队首次观察到硅基量子点（quantum dots，QDs）的ECL现象[17]，随着发光机制的研究深入，越来越多的具有ECL性能的纳米材料被发现。II-VI族半导体纳米晶（如CdSe QDs、CdTe@CdS QDs）、类石墨氮化碳（g-C3N4）、金属纳米团簇和聚合物点等[16,18]，是近年来研究较多的发光体。目前，纳米材料的ECL现象主要归因于表面缺陷效应和带隙效应。由表面缺陷效应产生的ECL光谱相比PL光谱有明显红移，且半峰宽明显大于PL光谱[14]，采用元素或分子掺杂改变纳米材料表面态可对其光谱特征进行调控[14]；将纳米材料表面钝化，如核壳结构的ZnS@CdSe QDs，可实现带隙效应ECL，其光谱特征与PL光谱基本一致，主要受纳米材料尺寸影响[14,16,18]。

2.2 共反应剂

共反应剂是指易被电化学氧化还原生成具有较高氧化还原能态自由基，从而促进发光体激发态形成的物种[11,14]。与湮灭型ECL相比，共反应剂型ECL中共反应剂和发光体的氧化或还原几乎同时发生，有利于发光体激发态在水相中生成[11]。根据氧化还原性质不同，有阳极共反应剂和阴极共反应剂。阳极共反应剂有、亚硫酸盐和有机胺类化合物。有机胺化合物TPrA、TEA和2-N-二丁氨基乙醇（2-(butylamino)ethanol，DBAE）[7,19-21]，是目前较为常用的阳极共反应剂。阴极共反应剂主要有、H2O2和溶解氧[14,22-24]。上述共反应剂均为小分子化合物，主要通过扩散、吸附行为参与ECL过程，对浓度依赖性较高。高浓度的共反应剂对基于生物反应的ECL体系有不利影响，同时有些共反应剂自身存在微弱发光，易产生背景干扰[14]。针对这些问题，目前主要有如下改进策略：1）将共反应剂和发光体键合，缩短发光体与共反应剂之间的电子传输距离，减少共反应剂自由基在向发光体扩散过程中因弛豫效应导致的能量损失，从而降低共反应剂的用量[25]。2）开发纳米材料型共反应剂，如碳点、氮化硼QDs、g-C3N4和氮掺杂石墨烯QDs（NGQDs）等被报道可作为阳极共反应剂[26-30]。You Tianyan团队将NGQDs与@SiO2共价偶联，构建了一种自增强型发光体NGQDs-Ru@SiO2[30-33]，其中NGQDs充当内源性共反应剂。3）开发免共反应剂ECL体系。Lum和Ru(bpy)2(mcpbpy)2+之间存在能量共振转移（resonance energy transfer，RET）效应，Yuan Ruo团队将两者共价偶联，形成分子内能量转移路径，极大提高了RET效率和ECL信号强度，避免了共反应剂的使用[34]。Zou Guizheng团队通过电化学氧化纳米粒子注入价带空穴，利用该价带空穴与纳米粒子的内源性导带电子之间的复合反应，产生阳极ECL信号，实现了免共反应剂ECL[35]。

2.3 共反应促进剂和发光猝灭剂

共反应促进剂是一类能促进共反应剂分解成活性自由基或提升界面电化学行为，进而增强ECL信号的物种，主要是一些对共反应剂有催化活性的有机、无机分子或纳米材料[36]。金属氧化物、金属纳米颗粒和Hemin等是常用的阴极ECL共反应促进剂[24,37-40]。Khoshfetrat[38]和LV Xiaohui等[41]分别构建了发光体Lum-AgNPs，其中AgNPs作为共反应促进剂催化H2O2产生活性自由基；Xia Mengke等[42]构建了发光体Lum-PdNPs，其中PdNPs作为共反应促进剂催化O2还原产生超氧阴离子自由基和羟自由基。阳极ECL共反应促进剂种类较少，目前报道的主要是TiO2基和铜基纳米材料，能分别降低TPrA和TEA的氧化电位，促进相应自由基的生成[28,36,39,43]。

光的猝灭是构建ECL分析方法时较为常用的一类模式，这里我们将对ECL有猝灭作用的物质统称为猝灭剂，常见的猝灭机制有能量转移、电子转移和内滤效应[31,44-47]。二茂铁（ferrocene，Fc）及其衍生物和亚甲基蓝（methylene blue，MB）对Ru配合物和g-C3N4等发光体有显著猝灭效应，目前主要认为是通过电子转移或/和能量转移途径猝灭ECL[31,46]。You Tianyan团队以双链DNA（double-stranded DNA，dsDNA）为分子标尺，研究了Fc对猝灭的距离效应。该团队发现，当Fc与的距离小于8 nm时，Fc能高效猝灭ECL；当距离大于12 nm时，Fc+与激发态的能量转移路径受阻，此时Fc充当工作电极和对电极之间的氧化还原介体，提高电子传输速率，反而增强了的ECL[31]。

3 ECL在真菌毒素检测中的研究进展

3.1 ECL适配体传感器在真菌毒素检测中的研究

适配体（aptamer，Apt）是一类能和细胞、病毒、蛋白质和小分子化合物等靶标特异性结合的寡核苷酸序列[48]，一般来说，凡涉及抗体的领域，几乎都可用Apt替代。因此，Apt又被称为“化学抗体”。在分析化学中，Apt的优势主要有：1）相对于抗体，Apt的制备成本低、合成简单，应用普及性更高[48]；2）Apt易兼容各种基于核酸杂交的信号放大系统[49]，如滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）、杂交链式反应（hybridization chain reaction，HCR）、DNA步行器和自组装纳米结构体[22,50-53]，这些信号放大系统，或通过负载发光体或共反应促进剂增强ECL信号[37,50]，或用于锚定猝灭剂从而控制检测前的信号关闭状态[44]；3）相对于抗体，Apt的化学稳定性更高[48]。目前，能特异性结合OTA、AFB1、AFM1、ZEN和DON的Apt均有报道[54]。然而，相比抗体，Apt距商业化应用还有一定距离，主要原因有：1）特异性Apt的筛选难度大[48]；2）相对抗体，Apt与小分子靶标的亲和力较低，且对环境因素（如样品基质）较为敏感[55]。尽管如此，在科学研究中，ECL-Apt传感器近年来仍发展迅猛。根据构建原理，本文将ECL-Apt传感器归纳为“Turn on”“Turn down”和比率型（表1）。

表1 ECL Apt传感器在真菌毒素检测中的研究Table 1 Published studies on ECL Apt sensors in detection of mycotoxins

“Turn on”型ECL传感器，是指在未加检测物时，ECL信号处于关闭或半关闭状态，在检测物引发下，ECL信号产生或恢复。是一种性质和相似的发光体，在水溶液中带正电，可作为ECL指示剂插入至dsDNA沟槽中[50,56]。Lin Zhenyu团队将互补链DNA（cDNA）和Apt固定于电极，加入待测物OTA后，Apt从电极上释放，随后cDNA与后加入的锁式探针结合，启动RCA反应；反应结束后，向电极表面滴加，带正电的发光体插入至dsDNA沟槽，随后在共反应剂TPrA存在下，产生强烈的ECL信号[19,50]。该团队又利用的电荷性质，建立了一种均相、非标记的检测方法。简言之，在均相体系下，插入至Apt/cDNA复合体中，加入待测物OTA后，Apt与OTA结合致使cDNA解离，随后在核酸外切酶RecJf作用下，单链DNA被水解，OTA和脱落，脱落的OTA又参与到下一个循环反应中；将反应后的均相体系加入到表面负电的ITO电极上，游离的与电极通过静电作用结合，其余物质被清洗去除，从而获得较强的ECL信号[56]。

另一种是发光恢复型，先将发光体和猝灭剂共同锚定在电极表面，利用待测物与Apt的特异性结合，引发猝灭剂标记的核酸探针从电极表面释放，发光得以恢复。Yuan Ruo团队基于靶标OTA对Apt/DNAzyme纳米结构的自动解组装作用，提出了一种灵敏的ECL传感策略[22]。负载hemin的自组装Apt/DNAzyme纳米结构对O2/S2-发光体系有显著的猝灭效应，在OTA和核酸外切酶RecJf作用下，该纳米结构解组装，同时OTA被重复利用，导致更多的纳米结构解组装，ECL得以恢复，从而实现对OTA的检测。Wei Min等[44]以CdS QDs为能量供体，花菁染料Cy5为能量受体，基于RET原理构建了一种检测OTA的传感器。如图3所示，先将Cy5标记的DNA、OTA-Apt和DNA步行器混合液与CdS QDs修饰电极孵育，Cy5和CdS QDs之间存在RET效应，此时信号关闭；Apt与OTA结合后从DNA步行器上解离，随后暴露的DNA步行器3’端与Cy5-DNA杂交，在切刻内切酶Nb.BbvCI的帮助下，Cy5-DNA被切割，导致Cy5从电极表面脱落，ECL信号恢复。Zhong Xia[24]、Zeng Weijia[57]和Li Zongbing[60]等分别利用Fc对ECL的猝灭效应，将发光体与Fc分别标记的DNA探针通过杂交作用形成复合体，在待测物和酶助力的DNA步行器共同作用下，Fc从复合体中释放，ECL信号恢复。

图3 基于酶助力DNA步行器的ECL Apt传感器原理示意图[44]Fig.3 Schematic illustration of the working principle of ECL Apt sensor based on nicking endonuclease-powered DNA walking machine[44]

“Turn down”型传感器，通常是先将发光体修饰在电极表面，加入待测物后，引发ECL猝灭。发光猝灭的原因可以是待测物结合产生的位阻效应[63-64]，可以是待测物与Apt结合后使发光体[23,38,52]或能量受体从传感界面脱落[61]，也可以是引入更多的猝灭剂或提高猝灭剂的猝灭效率[34,46]。将发光体和Apt修饰在电极上，待测物与Apt结合后能阻碍发光体和共反应剂接触、降低传感界面的电子传输速率从而猝灭ECL是一种简便可行的策略。Luo Lijun[30]、Jia Mingxuan[64]和Tian Chunyuan[63]等分别将Apt标记在发光体NGQDs-Ru@SiO2、CdSe@CdS QDs和Gd(OH)3纳米晶修饰的电极上，实现了对真菌毒素的直接检测。Lu Yan等[62]为提高传感界面对待测物的敏感性，在修饰发光体和Apt之前，先通过电沉积手段在电极表面制备聚(6-羧基吲哚)和纳米金花复合物（PICA/F-Au），用于提高电极的比表面积和导电性，从而构造对待测物较为敏感的传感界面。该策略的特点是检测快速和成本低，然而，真菌毒素是小分子，通过位阻效应猝灭ECL的效率较低，检测方法的分辨率和检测范围通常不理想。

另一种策略是利用cDNA和发光体标记的Apt修饰电极，加入待测物后，发光体标记的Apt解离，ECL信号降低。Wang Zhouping等[23]采用cDNA与N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺（N-(4-aminobutyl)-N-ethylisoluminol，ABEI）标记的Apt形成dsDNA，加入OTA后，ABEI标记的Apt从电极上释放，ECL信号降低。该方法中，ABEI是单分子标记，ECL信号较弱。Khoshfetrat等[38]构建了Lum功能化AgNPs修饰的氧化石墨烯（Lum-AgNPs-GO）发光体，其中GO提高了Lum和AgNPs的负载量，AgNPs为共反应促进剂，极大提高了Lum的发光强度。Ge Junjun等[52]采用自组装DNA纳米管负载，加入待测物AFB1后，AFB1与Apt结合导致DNA纳米管解体，发光体从电极表面释放，ECL信号显著降低。

此外，通过Apt与靶标结合从而向ECL体系中引入或去除能量转移或电子转移受体，也是一种常见策略。Yuan Ruo团队[34]以Lum-Ru为发光体，在DNA聚合酶和切刻内切酶辅助下，同时基于靶标引发的循环放大策略向发光体修饰的电极表面引入大量Fc标记的核酸探针，从而高效猝灭Lum-Ru的发光，实现了对AFM1的灵敏检测。该方法无需共反应剂，避免了其对分析体系的不利影响。Tian Dongyan等[46]基于Fc对发光体g-C3N4的猝灭效应设计了一种颇为简便的传感器，首先利用NH2-Apt与羧基化的g-C3N4共价偶联，随后将其修饰在电极表面，因Apt的3’端标记了Fc，且Apt为线性构型，此时，Fc与g-C3N4的距离较远（＞10 nm），Fc的猝灭效率较低；加入待测物与Apt结合后，Apt折叠，拉进了Fc与g-C3N4的距离，猝灭效率提升。Gao Jingwen等[61]以CdTe QDs为能量供体（标记cDNA）、Cy5为能量受体（标记Apt），基于能量转移构建了发光强度较高的传感界面（此时CdTe QDs与Cy5的距离约4 nm），Cy5-Apt与待测物结合后从电极表面释放，ECL信号降低。

双信号响应型传感器，是指在检测某一靶标时，传感器有两种信号输出，这两种信号反映的是同一生物反应过程，其中一种信号可作为另一种信号响应的参考，用于研判检测方法的测试准确度[31,33]。如果两种信号响应与待测物含量具有较好的相关性，建立两种信号的比值与待测物含量的化学计量关系，即为比率型传感器[66]。双信号/比率型传感器能在一定程度上减少复杂环境对分析方法的干扰，提高定量的准确性[66-67]。目前，该类型的ECL传感器在真菌毒素检测研究中尚处于起步阶段。You Tianyan团队[33]以发光体NGQDs@SiO2标记cDNA、Au NPs修饰磁珠（Au@MB）标记Apt，构建了一个均相检测体系，该体系中，用磁性电极回收磁珠，测试ECL信号，同时采用荧光仪测试上清液中剩余发光体的荧光信号，分别建立ECL信号和PL信号与待测物浓度的响应关系，但研究者未对两种方法的相关性做进一步讨论。随后，该团队基于Fc与发光体NGQDs-Ru@SiO2的距离效应，建立了ECL/EC双信号响应传感器[31]。研究发现，当AFB1质量浓度在1 pg/mL～300 ng/mL时，ECL/EC信号比值较为恒定（变异系数小于5.9%），两种信号有较好的相关性。该团队又基于该发光体构建了双猝灭-比率型ECL传感器[32]。如图4所示，将cDNA吸附于发光体修饰的电极上，加入结合ZEN的Apt（ZEN binding aptamer，ZBA）与之杂交，随后加入MB，MB插入至dsDNA中；加入待测物ZEN后，ZEN与ZBA结合致使MB释放。该研究中，MB被证实对发光体（Ru@SiO2）和共反应剂（NCQDs）存在双重猝灭效应，MB的释放使ECL信号显著恢复，因此ZEN含量与ECL信号存在正相关性；此外，MB的电化学（EC）信号与ZEN浓度有负相关性。由此建立的比率型传感器具有较高的定量准确性。Lin Yue等[21]将MB标记的DNA作为内参比探针结合于电极表面，测试中MB的EC信号反映了其在工作电极表面的状态，作为内参比信号保持恒定，由此建立的ECL/EC比率传感器可一定程度上消除工作电极带来的误差。ECL/EC比率型传感器需对同一传感界面重复施加电位，测试中有诸多不便。Wu Long等[65]采用CdTe/CdS/ZnS QDs和Lum同时修饰电极，利用两种发光体的激发电位不同，构建了一种电位分辨型ECL传感器，该传感器中，QDs为阴极电位激发，Lum为阳极电位激发，因电位激发存在时间差，两个发光体的ECL信号在图谱上是独立呈现的，可实现一次激发同时收集两种检测信号。此外，还有波长分辨型、双电极内参比型ECL传感器[66]，但在真菌毒素检测中尚未普及。

图4 基于MB对自增强发光体NGQDs-Ru@SiO2的双重猝灭效应构建的ECL比率传感器示意图[32]Fig.4 Schematic illustration of ECL ratiometric Apt sensor based on the dual-quenching effect of MB on NGQDs-Ru@SiO2[32]

3.2 ECL免疫分析在真菌毒素检测中的研究

ECL免疫分析技术是继免疫放射、酶联免疫吸附和化学发光免疫技术后的新一代分析技术，其集成了免疫分析和ECL各自特点，在近20 a的临床检验中展示出了高度的敏感性、特异性、稳定性和可控性，且有测定范围宽、检测速度快并易于自动化等特点[68]。ECL免疫分析技术在食品安全中的研究可追溯到1996年，Yu等[69]将该技术首次用于食品中大肠杆菌O157:H7和沙门氏菌的检测。随后的十数年间，ECL免疫分析在食品安全领域的研究主要是围绕及其衍生物展开。随着纳米技术的兴起和ECL机理的研究深入，ECL免疫分析技术在食品安全检测领域取得了一定进展（表2）。

表2 ECL免疫传感器在真菌毒素检测中的研究Table 2 Published studies on ECL immunosensors in the detection of mycotoxins

真菌毒素的ECL免疫分析主要有直接检测（非标记）和竞争检测（标记）法。非标记ECL免疫分析，一般是在电极表面依次固定发光体、特异性抗体和封闭蛋白，然后将电极与待测样品接触，电极表面的抗体即可结合样品中的真菌毒素。真菌毒素结合在电极表面后，通过位阻效应导致ECL信号下降[40-41,70-71]。该法的特点是传感器制备简单、测试速度快、能实现在线监测，但缺点也很明显。第一，真菌毒素为小分子化合物，空间位阻小，与抗体结合后很难显著降低ECL信号，因此该法的灵敏度和分辨率较低。为了解决这个问题，主要从电极修饰材料入手，提高传感界面的导电性和发光体的发光效率，从而提高对真菌毒素的敏感度。例如，Wei Qin团队[72]以介孔碳（mesoporous carbon，MC）负载的Lum功能化AgNPs（Lum-AgNPs）修饰电极，MC具有大的比表面积和较好的导电性，不但增加Lum的负载量，也是良好的电子传输媒介，显著提高了传感界面对AFB1的敏感性。该团队又将SiO2NPs负载的（RuSi@与Au NPs修饰的纳米多孔钴和四氧化三钴（Co/Co3O4-Au）复合，作为电极修饰材料，Co/Co3O4-Au是优良的复合催化剂，充当共反应促进剂提高ECL效率，增强了传感界面对待测物的敏感度[40]。此外，Lv Xiaoyi等[39]以TPETTZ（一种多环芳烃化合物）聚集体为发光体，与PANI包裹的TiO2NPs（PANI/TiO2NPs）复合后作为电极修饰材料，其中PANI具有较高的导电性，TiO2NPs一方面可作为共反应促进剂，另一方面，可作为TPETTZ的能量转移供体，提高传感界面的发光效率。虽然上述策略可在一定程度上提高方法的灵敏度，但是方法的分辨率仍然不够理想[41]。第二，方法的特异性和检测的准确度难以保证。不同的样品基质成分，对抗原抗体反应有多种可能的影响，某些基质成分可能吸附在电极表面，实际应用中无法判断ECL信号的改变是因为特异性结合还是非特异性吸附，导致测试结果的可信度不高。

竞争型ECL免疫分析法，需要引入人工抗原或多肽模拟表位等作为竞争者[43,74]，建立其与待测物竞争结合抗体的反应体系。该法需要对抗原或抗体进行标记，标记物可以是发光体，也可以是猝灭剂。如图5所示，在电极表面固定真菌毒素抗体（或人工抗原）后，加入人工抗原（或抗体）标记的发光体与待测真菌毒素形成三位一体的竞争反应体系，电位激发下，发光体的发光强度与待测真菌毒素浓度呈负相关性，可以实现真菌毒素的定量。此外，也可将发光体和抗体（或人工抗原）固定在电极表面，加入人工抗原（或抗体）标记的猝灭剂与待测真菌毒素形成竞争反应体系，发光体的ECL信号与待测真菌毒素浓度呈正相关性。Wei Qin团队[74]以草酸为配体与Cu2+、Ni2+合成3D配合物，进而负载构建发光体{[Ru(bpy)3][Cu2xNi2(1-x)(ox)3]}n（Cu/Ni/Ru），并借助Au NPs固定抗体，随后加入AuNPs-PEI@SiO2标记的AFB1-BSA（作为免疫探针）与测待物AFB1竞争结合抗体。当免疫探针与电极上的抗体结合后，PEI会与草酸竞争络合发光体中的Cu2+和Ni2+，使3D配合物解体，从而释放，造成ECL信号降低。Xia Mengke等[42]将Lum和PdNPs-GO复合，构建了自增强型发光体，其中，GO提高了Lum和PdNPs的负载量，是优良的电子传输媒介，此外，PtNPs能够催化溶解氧还原，提高Lum的发光效率。Lv Xiaoyi等[75]以共价有机聚合物（covalent organic polymer，COP）T4VTP6为发光体，二茂铁甲醛与苯丙氨酸偶联物（FcCHO/Phe）标记的人工抗原为免疫探针，构建了竞争型ECL免疫传感器，该研究中T4VTP6同时作为纳米反应器，原位还原Pt4+得到PtNPs，充当共反应促进剂和抗体固定介质。

图5 ECL免疫传感器构建原理Fig.5 Schematic illustration of the construction principle of ECL immunosensors

比率型ECL免疫传感器在真菌毒素检测中亦有报道。Lv Xiaoyi等[77]构建了一种ECL/EC比率型传感器，其中EC信号来源于电极修饰材料Fc-MOF，作为内参比信号保持恒定，ECL信号来源于发光体BPYHBF（一种荧光染料），在竞争免疫分析模式下，ECL/EC信号比值与AFB1浓度之间存在良好的线性关系。随后，该团队以有机硼复合微棒（IBPHF）为发光体，构建了一种电位分辨型比率传感器，IBPHF能在阴极电位（-1.5 V）和阳极电位（1.5 V）下分别产生ECL信号[78]。然而，该研究同时采用了K2S2O8和TPrA做共反应剂，这两种共反应剂产生的自由基会互相猝灭，导致阴极和阳极的ECL信号不高。Fang Dandan等[76]采用两个发光体建立了一种电位分辨型ECL传感器，其中g-C3N4标记ZEN抗体作为电极修饰材料，自增强型发光体ABEI-GSH标记人工抗原作为检测探针，H2O2为共反应剂，可同时检测到阴极ECL（g-C3N4）和阳极ECL（ABEI）信号。

3.3 ECL分子印迹传感器在真菌毒素检测中的研究

分子印迹技术是一种以目标物分子为模板，合成对其有特异性识别功能聚合物的仿生技术，该技术的核心为分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）[79]。在模板分子、功能单体和交联剂存在下，受引发剂、光、电或热等因素引发，在模板分子-功能单体主客体配合物周围发生聚合反应，并采用适当方法从上述高度交联的聚合物中去除模板分子，得到与目标分子结构互补的识别空穴，即为MIP[80-85]。MIP与目标物分子的关系类似抗体与抗原，因此MIP又被称为“人工抗体”。与抗体和Apt等生物识别元件相比，MIP对酸、碱和有机溶剂有更高的耐受性，稳定性较好[79]。ECL-MIP传感器将MIP的高度稳定性、特异性和ECL的高灵敏性、可控性集为一体，近年来受到一定关注。

Zhang Xiuhua团队[80]在真菌毒素的ECL-MIP传感器研究中做了系列工作，他们先在电极表面修饰发光体，随后加入模板分子（OTA）、功能单体、交联剂和引发剂，UV引发启动聚合反应，在去除模板分子后，得到了MIP，随后以TPrA为共反应剂，实现了对OTA的检测，检出限为0.03 ng/mL，检测范围0.1～10 ng/mL。鉴于该传感器的ECL信号不高，该团队对其进行了改进，先采用SiO2NPs负载的（Ru@SiO2）修饰电极，再行制备MIP[81]，由于发光体的负载量得以提高，改进后的传感器对OTA的检测灵敏度和检测范围明显改善，检出限达到27 fg/mL。紧接着，他们在第一次改进基础上进行了再次改进，仅在ECL测试电解液中加入了CdTe QDs[82]，由于CdTe QDs与Ru@SiO2存在能量转移，传感界面的ECL信号强度与第一次改进相比提高了约8 倍，但是，CdTe QDs存在于电解液中，与发光体距离较远，能量转移效率低。于是，他们在第二次改进基础上再次改进，将CdTe QDs与共同修饰在SiO2NPs上，以缩短能量受体（CdTe QDs）与能量供体的分子间距离，提高能量转移效率[83]。上述MIP-ECL传感器均是先将发光体修饰在电极上，而后在发光体上合成MIP，发光体与共反应剂被MIP阻隔，导致ECL效率不高。于是，该团队[84]和Wei Jinliu[85]等均采用共聚合策略，将发光体与模板分子、功能单体、交联剂和引发剂混合后，于电极表面共聚合制备MIP，因增大了发光体和共反应剂的接触面积，ECL信号得以明显提升。

4 ECL在食品安全检测中存在的主要问题和挑战

4.1 生物分子标记

构建生物传感器时，通常需要对生物分子（Apt、抗原或抗体）进行标记（或固定）。目前常用的标记方法有共价偶联法、非共价吸附法和自组装标记技术。共价偶联法反应较为剧烈，对ECL试剂和生物分子活性存在一定程度的破坏；非共价吸附力较弱，易导致标记物脱落；自组装标记技术中形成的Au-S或Au-N等化学键，在ECL测试中易受高电位氧化破坏[8]。在ECL中，理想的标记方法应满足：1）标记条件温和，且ECL试剂和生物分子之间有适当的连接臂；2）对生物分子能够定点或定向标记，以充分暴露其活性位点，减少与目标物结合的空间位阻；3）尽可能提高ECL试剂与生物分子的标记比，即在保证生物分子活性的前提下，使每一个生物分子标记更多的ECL试剂；4）标记方法简单易行，成本低。

4.2 基质效应

通常，在较高电位下激发、使用高浓度共反应剂的前提下，才能获得相对满意的ECL效率。然而，食品基质成分复杂，其中存在含量较高的如氨基酸、矿物质和维生素等电化学活性物种，可能会非特异性吸附在工作电极表面，对ECL测试产生一定干扰。ECL作为一种快速检测手段，不宜引入较为复杂的样品前处理过程，否则将减弱方法学优势。目前，研究者主要采用提高传感器的灵敏度进而提高待测样品稀释倍数的策略消除基质效应。然而，一些真菌毒素本身也会在高电位下被氧化[58]，改变自身结构，进而影响抗体、Apt或MIP对其准确识别。因此，开发能在低电位下高效激发的新型ECL体系是非常重要的研究方向，如开发带隙较小的纳米材料类发光体、开发低氧化电位的共反应剂或引入高效的共反应促进剂，以及优化它们之间的配伍，是较为可行的思路[86-87]。

4.3 满足现实需求

ECL传感器的研究与开发应围绕灵敏度高、检测速度快、成本低和方法简单等核心优势，将其定位为一种可快速、准确筛查并可在线实时监测的重要手段。在ECL传感器研究中，常通过引入复杂的信号放大系统（如RCA和DNA纳米机器）以提高方法灵敏度。然而，这类信号放大系统依赖于复杂的生物反应和较多的生物试剂（如多种核酸探针和核酸酶），从而引入诸多不确定性因素，同时增加了检测时间和成本。如何平衡方法的高灵敏度和易操作性，是ECL在现实应用中需要考虑的实际问题。

检测准确度是检测方法最为核心的性能评价指标之一。比率型传感器具有相对高的检测准确度，如前文所述，目前在真菌毒素检测中以ECL/EC型传感器为主，这类传感器在测试中需对同一传感界面重复施加电位，不仅增加了测试步骤，也会改变界面电化学性质。电位分辨型ECL传感器，即一次电位扫描产生两个独立的ECL信号，两个信号反映的是同一生物反应过程和同一传感界面状态。这两个信号可以是同步的，也可以是反向的，具有较好的相关性，能更准确地反映待测物的真实含量。目前，这类模式的比率型传感器在体外诊断领域发展迅速，有诸多可借鉴的策略。此外，还有波长分辨型传感器，即一个或两个发光体在电位激发下，产生两个独立发射波长的ECL信号，然而，目前多数设备仍需重复扫描分次采集两个波长的信号，能单次扫描同时获得两个发射波长信号的ECL设备是当下亟需普及的。

5 结语

ECL在体外诊断行业的商业化，激发了食品安全领域研究人员的研究兴趣。鉴于真菌毒素的高毒性和污染普遍性，在能快速、灵敏、准确和低成本检测的前提下，兼顾检测方法的高通量、自动化和便携化，是当下ECL研究中较为适合的目标。目前ECL在真菌毒素检测中的研究尚处于起步阶段，理论基础相对匮乏。今后应围绕食品基质成分的特殊性，研究适合于食品污染物检测的新型ECL体系，例如对食品基质有抗干扰作用的ECL发光体。此外，现有的共反应剂本身多是有毒物质，开发绿色环保的共反应剂乃至免共反应剂ECL体系，也是未来应侧重的研究方向。最后，研究开发以实际应用为目标的ECL检测方法和设备，是相关研究人员未来努力的方向。