不同品牌胶体金免疫层析试纸条/卡检测牛羊布鲁氏菌病的效果分析

汪洪冰，郭永祥，张朝阳，黄建龙，张 坤，林 源

（湖南省动物疫病预防控制中心，湖南长沙 410014）

布鲁氏菌病（brucellosis，以下简称布病）是由布鲁氏菌属细菌感染导致的人兽共患传染病，在世界范围内严重威胁人类健康并影响畜牧业发展[1]。血清学诊断是布病初筛和确诊的主要临床诊断方法。国家标准《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18646—2018）和世界动物卫生组织（WOAH）推荐的布病血清学诊断方法主要有虎红平板凝集试验（RBPT）、试管凝集试验（SAT）、补体结合试验（CFT）及酶联免疫吸附试验（ELISA）等。然而近些年，胶体金免疫层析技术作为一种新型快速发展的免疫学检测技术，因其成本低廉、检测速度快、操作简便、特异性强、灵敏度高、结果可靠，无需特殊仪器设备等优点[2-4]，已被广泛应用于动物病毒、细菌等病原检测，并已成为兽医临床诊断动物疫病最简单、快速、敏感、特异的免疫学检测技术之一。尽管早期已有相关研究将此技术与其他布鲁氏菌检测方法进行了比较，但同时运用不同品牌胶体金免疫层析试纸条/卡（简称试纸条/卡）检测牛羊布鲁氏菌的报道较少见。本研究为比较不同品牌试纸条/卡检测性能，利用抗体布鲁氏菌阴阳性血清，对6 种试纸条/卡的准确性及敏感性进行验证，并对经RBPT 初筛和竞争酶联免疫吸附试验（cELISA）复核的临床血清样品进行检测比对，以期为利用试纸条/卡进行布鲁氏菌快速检测提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 血清样品

布鲁氏菌企业标准阴性血清和阳性血清（以下简称标准阴阳性血清），批号50042308，有效期至2023 年12 月14 日，购自青岛立见生物科技有限公司；临床血清样品，来自某实验室，其中羊血清34 份（阴阳各17 份）、牛血清44 份（阴阳各22 份）。所有血清样品均已按GB/T 18646—2018 标准完成了RBPT 初筛和cELISA 复核，无明显溶血等情况。

1.2 试剂

在有效期内的6 个品牌（A—F）试纸条/卡，购自湖南省政府采购电子卖场某供应商。

1.3 方法

1.3.1 准确性比较 直接选取标准阴阳性血清，按试纸条/卡使用说明书进行检测，每种试纸条/卡重复检测3 次，以了解不同品牌试纸条/卡对标准阴阳性血清检测的准确性。

1.3.2 检出限试验 将标准阳性血清按比例依次稀释到1:256，选择不同稀释倍数阳性血清，按试纸条/卡使用说明书进行检测，以了解试纸条/卡对阳性血清检测的灵敏度。

1.3.3 临床样品检测 选取经RBPT 初筛和cELISA 复核的临床血清样品，分羊、牛不同畜种，按试纸条/卡使用说明书对临床血清样品进行检测，以了解不同品牌试纸条/卡对临床样品的检测效果。

2 结果与分析

2.1 准确性

经3 次重复检测，各试纸条/卡对标准阴阳性血清的检出率均为100%，表明各品牌试纸条/卡的检测准确率高，稳定性好。

2.2 灵敏度

如表1 所示：各试纸条/卡对不同倍比稀释的标准阳性血清检测结果不同，C、D 试纸条/卡敏感性最高，对1:2～1:256 不同倍比稀释的阳性血清检出率均为100%；B 试纸条/卡敏感性一般，对1:2～1:16 不同倍比稀释的阳性血清检出率为100%；A、F 试纸条/卡敏感性较差，仅能检出1:2～1:4 低倍比稀释的阳性血清；E 试纸条/卡敏感性和稳定性相比最差。

表1 不同品牌试纸条/卡对不同倍比稀释标准阳性血清样品的检测结果

2.3 临床血清样品检测

如表2、3 所示：各试纸条/卡对临床阴性血清样品的检测准确率均为100%。对临床羊阳性血清样品的检测结果差异较大，其中B 试纸条/卡阳性检出率最高（70.59%），其次为F 试纸条/卡阳性检出率（64.71%），A 试纸条/卡阳性检出率最低（5.88%）；对临床牛阳性血清样品的检测结果整体优于羊阳性血清样品，但不同试纸条/卡的检测结果仍然存在差异，E、F 试纸条/卡阳性检出率最高（100%），其次为A、D 试纸条/卡（68.18%），B、C 试纸条/卡最低（50.00%）。

表2 不同品牌试纸条/卡对临床羊血清样品的检测结果

表3 不同品牌试纸条/卡对临床牛血清样品的检测结果

3 讨论

胶体金免疫层析法是将胶体金标记技术、免疫检测技术和蛋白层析技术相结合的以硝酸纤维膜为载体的固相膜免疫分析技术[5]，具有简便、省时、样本用量少、结果易判读等特点，常在资源匮乏或非实验室环境中进行目标物的定性、半定量和定量检测。应用范围包括生物医学中的病原体、药物、激素和代谢物检测，植物检疫，兽医、饲料/食品和环境指标的测试。2019 年，国家卫生健康委员会发布《布鲁氏菌病诊断》（WS269—2019），新增了胶体金免疫层析法诊断布病的参考标准，并将其作为布病初筛试验之一。在动物疾病的临床检测及防控上，胶体金免疫层析技术近年来也有大量的创新和应用，新材料、新仪器和新技术的发展给胶体金免疫层析技术带来更多可能[6]。全国动物卫生标准化技术委员会对《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18648—2018）进行修订立项，在新修订的征求意见稿[7]中将免疫层析抗体检测方法列入布病的免疫学诊断方法。这预示着胶体金免疫层析技术在布病诊断上将发挥越来越重要的作用。

在早期报道中，有研究者对胶体金免疫层析法与其他布病诊断方法进行了比较[8-13]，也有用胶体金免疫层析法横向比较牛/羊血清样品检测效果的研究[14-16]，结果均显示胶体金免疫层析法具有较高的特异性和敏感性，适应于布病初筛。本研究发现不同品牌试纸条/卡对企业提供的标准布鲁氏菌阴阳性血清均敏感，但检出限并不一致，这说明即使是同一种检测方法，不同试纸条/卡的检测结果也存在差异。同时，应用同一品牌试纸条/卡分别检测牛羊阳性血清时，其检测结果也不相同。B 试纸条/卡对临床羊阳性血清样品的检出率达70.59%，对临床牛阳性血清样品的检出率仅为50%；A 试纸条/卡对临床羊阳性血清样品检出率仅为5.88%，但对临床牛阳性血清样品的检出率却达68.18%；E、F 试纸条/卡对临床羊阳性血清样品的平均检出率为61.76%，但对临床牛阳性血清样品却100%检出。这与刘丽娅等[16]在对布病不同初筛方法及诊断试剂检测差异性分析时所发现的“应用同一方法，采用不同试剂结果存有差异；应用同厂家试剂，检测牛、羊血清，敏感及特异性结果也有不同”，具有相似性。准确检疫和快速诊断是预防和控制布病的关键。在开展布病净化时，建议先通过动物布病国家标准诊断技术与试纸条/卡进行效果比对，根据对比结果选择敏感性较好、准确性较高的商品化试纸条/卡用于快速检测和现场诊断。但初筛完成后，仍需用敏感性、特异性均好的其他检测方法进行复检，确保检测结果的准确性。

胶体金免疫层析法是根据待测物与相应抗体剂量-反应曲线进行定性和定量检测的，因此为了得到准确结果，必须有相对于待测物的过量抗体，包括捕获抗体和金标抗体（免疫胶体金）[17-19]。有文献[12]报道布鲁氏菌抗原间交叉反应，类风湿因子、嗜异性抗体等内源性干扰物质，标本凝固不全便开始离心，血清中残留的纤维蛋白原粘附硝酸纤维素膜（NC 膜）等外源性因素，以及试纸条/卡本身质量问题、溶血、乳糜血等原因，均可对胶体金检测结果造成干扰。因此选择高质量试纸条/卡的同时，规范的样品采集、预处理方法，合适的分析物浓度等对提高检测灵敏度至关重要[20]。本研究发现不同品牌试纸条/卡对临床阳性血清样品的检测结果差异性较大，这可能与各品牌试纸条/卡在生产过程中胶体金颗粒大小的均匀度、浓度，抗原抗体比例，以及NC 膜、金标垫等材料质量密切相关[21]。同时，本研究也发现不同品牌试纸条/卡对标准阳性血清、临床阳性血清样品的检测结果差异较大，这可能与标准阴阳性血清制备以及检验的程序化、制度化密切相关，相比临床阴阳性血清，标准阴阳性血清的均匀性、稳定性优势更加明显。建议各相关生产厂家应建立统一的产品标准生产程序和判读标准，从胶体金、抗体等原料的质量，膜材的处理，到试纸的组装、储存等加强品控管理，确保生产出特异、灵敏且经济实惠的试纸条/卡，以利于生产实际中布病的初步检测和大批量筛查[16]。

检测结果除与试纸条/卡产品质量参差不齐有关外，还可能与采样动物的健康状况、近期饲料添加剂及药品使用情况，染疫动物体内抗体消长变化情况，以及临床样品的前期处理和检测时的环境温度、试剂温度、样品温度、判读时间和加样量等具有一定相关性[19]。在兽医临床快速检测和现场诊断中，建议详实了解采样动物饲养背景、健康状况，采用规范的采样方法和血液样品预处理方法，严格对照试纸条/卡产品说明进行检测操作，以便充分发挥胶体金免疫层析检测的优势。