猪肺炎支原体SYBR Green I 实时荧光定量PCR 检测方法的建立与应用

闫 微，杨 柳，龙云志，宋文博，李倩倩，余道兵，周明光，徐高原，黄 超，汤细彪

（武汉科前生物股份有限公司，湖北武汉 430070）

猪支原体肺炎又称猪喘气病或猪气喘病，是由猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp）引起的一种接触性慢性呼吸系统传染病[1]。猪支原体肺炎病猪常见的临床症状包括发热、咳嗽、呼吸困难、食欲减退、饲料转化率低等。Mhp通常不引起猪死亡，但一旦感染猪群，就很难被彻底清除，将持续影响猪的生长发育[2]。此外，Mhp常与其他病毒或细菌发生混合感染引起猪呼吸系统疾病综合征（porcine respiration disease complex，PRDC），严重影响猪群出栏率[3]。目前，Mhp 在猪场呈普遍流行趋势，给生猪养殖带来了巨大经济损失[4]。据报道[5]，全世界家猪群中的Mhp 平均感染率为30%～80%，发病率在40%以上[6]。宋志强等[7]对我国26 个省份2016—2019 年的35 995头肥猪进行屠宰检查，发现Mhp 平均阳性率为67%，并估算出我国养猪业在这4 年间因猪支原体肺炎产生的损失年均高达82.8 亿元。

目前，预防和控制猪支原体肺炎的主要措施是接种疫苗，在我国主要使用灭活疫苗[8]。然而，近些年来，随着Mhp 流行株的逐渐变异，临床上经常出现疫苗免疫效果不佳的情况。此外，灭活疫苗也存在一些缺点。比如：不同批次间的有效抗原含量相差较大，质控检验困难；不同流行株间的同源性差异较大，对同源性较低流行株的保护效果不理想[9]。

灭活疫苗中的抗原含量是决定Mhp 疫苗质量和免疫效力的关键因素之一。而对于Mhp 抗原含量测定，通常采用颜色改变单位（color changing units，CCU）法[10]。但传统的CCU 法测定过程漫长且繁琐，不适用于灭活疫苗生产及成品疫苗中的有效抗原含量测定。然而，在实际生产中，常常只有知道培养的Mhp CCU 才能确定其是否能用于疫苗制备及后续研究[11-12]。为了更快捷准确获得或快速检测试验生产及市售疫苗中Mhp 的CCU，本研究建立了一种快速高效获取支原体CCU 的方法——SYBR Green I 荧光定量PCR 方法，为实际生产及临床应用都提供了很大便利。

1 材料和方法

1.1 菌株与病毒

Mhp ES-2 株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2018570。猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、副猪嗜血杆菌4 型（HPS4）及链球菌2 型（SS2），均由武汉科前生物股份有限公司临床猪病研究室分离、鉴定和保存。

1.2 主要试剂

2×EasyTaqPCR Super Mix（-dye）， 购自北京全式金生物技术有限公司；电泳使用的所有Marker、载体PMD18-T、限制性内切酶及连接酶，均购自Takara 生物技术有限公司；凝胶电泳涉及的琼脂糖，购自Biowest 公司；新型核酸染料Gelred、50×TAE 缓冲液，均购自Biosharp 公司；DNA 回收试剂盒、质粒小提试剂盒，均购自天根生化科技（北京）有限公司；支原体全基因组提取试剂盒，购自Biomiga 公司；SYBR Green Master Mix，购自诺唯赞生物科技股份技术有限公司。

1.3 主要仪器

普通PCR 仪及荧光定量PCR 仪，均购自Bio-RAD 公司；电热恒温养箱，购自广东泰宏君仪器有限公司。

1.4 引物及序列

本研究使用的所有引物均通过Primer 5 软件设计，由武汉擎科创新生物科技有限公司合成，引物信息见表1。

表1 引物信息

1.5 最佳引物筛选

以ES-2 株全基因组为模板，用Mhp 标准引物构建内参质粒。对内参质粒进行10 倍倍比稀释（做9 个稀释度）将其作为荧光定量PCR 筛选最佳引物的模板，其中最大拷贝数浓度为4.9×109copies/μL，最小为4.9×101copies/μL，并以ddH2O 作为阴性对照。扩增体系及程序：2×AceQ qPCR SYBR Green master mix 10.0 μL，上下游引物各0.4 μL，DNA模板2.0 μL，50×Rox Reference Dye 0.4 μL，最后用无菌ddH2O 补至20.0 μL。反应条件：95 ℃2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 35 s，40 个循环。溶解曲线分析从60 ℃到95 ℃。观察并比较4种引物（SX1、SX2、SX3 和SX4）的qPCR 最低检出模板浓度，并以此为标准筛选出最佳引物对。

1.6 引物特异性检测

对筛选出的最佳引物分别进行Mhp 和其他病毒（PPV、CV2 和PRV）及细菌（HPS4、SS2）的荧光定量PCR 检测，以确定引物特异性。

1.7 标准曲线绘制

将支原体按1:10 比例接种于含5 mL 液体培养基的西林瓶内，静置于37 ℃恒温培养箱内培养至平台初期；在超净工作台吸取100 μL 接种于含900 μL 培养基的西林瓶内，进行10 倍倍比稀释，共计稀释10～12 份，同时用支原体空白培养基作为阴性对照；在37 ℃温箱中静置培养14～21 d，肉眼观察西林瓶变色的最大稀释度即为支原体的CCU。将含量为1.0×108CCU/mL 的培养至平台期的支原体进行10 倍倍比稀释，选取6 个稀释度（10-4～10-9），每个梯度分别取200 μL 提取基因组，以此为模板并以支原体培养基为阴性对照，分别进行荧光定量PCR 扩增，以支原体CCU 的对数值为横坐标，对应的Ct 值为纵坐标绘制标准曲线。

1.8 建立方法稳定性检测

选取3 份已知不同CCU 含量的样本进行10倍倍比稀释，每个样本稀释10 份，最后一管出现颜色改变定为1 CCU/mL，推导出原支原体菌液的CCU。每份支原体样本取200 μL 提取基因组，以此基因组为模板进行荧光定量PCR 扩增，将所得Ct 值代入标准曲线方程，计算出对应的CCU。比较检测出的CCU 与计算出的CCU 之间的差异，验证建立方法的稳定性。

1.9 灭活与未灭活支原体Ct 值比较

对支原体使用0.01%的硫柳汞在2～8 ℃条件下灭活16 h，将灭活与未灭活的支原体分别提取基因组DNA 进行荧光定量PCR 扩增，得到Ct 值后进行比较。

1.10 疫苗生产中抗原含量检测和市售疫苗CCU测定

吸取两份疫苗生产中的支原体菌液各200 μL，一份提取基因组进行荧光定量PCR，将检测所得Ct 值代入标准曲线方程计算出对应的CCU，另一份使用倍比稀释法测定其中的CCU，然后比较两种方法所得结果。

分别吸取4 种市售Mhp 灭活疫苗250 μL（体积比，抗原:佐剂 = 4:1）提取基因组作为实验组，进行荧光定量PCR 检测，将检测所得Ct 值代入标准曲线方程计算支原体对应的CCU，验证疫苗中的CCU。

2 结果与分析

2.1 最佳引物筛选

以ES-2 株全基因组为模板，用引物MHP-F和MHP-R 构建内参质粒，对单菌落进行PCR 鉴定，结果见图1。将内参质粒10 倍倍比稀释9 个梯度（4.9×109～4.9×101copies/μL），并以ddH2O作为阴性对照，依据灵敏度和曲线拟合度，筛选出最佳引物，发现引物SX4 效果最佳，其灵敏度为4.9×101copies/μL，R2= 0.990 1（图2）。

图1 内参质粒阳性克隆鉴定结果

图2 4 对引物的荧光定量PCR 结果及拟合曲线

2.2 引物特异性检测

利用SX4 引物分别对Mhp、PPV、PCV2、PRV、HPS4 及SS2 进行引物特异性检测，结果除Mhp 外其他病原均无扩增（图3），说明该引物特异性良好。

图3 引物特异性检测结果

2.3 支原体CCU 和荧光定量Ct 值之间的相关性

提取灭活前与灭活后支原体的基因组DNA进行荧光定量PCR 检测，结果灭活前的Ct 值为18.23，灭活后为18.31（图4）。由此可知，支原体在灭活前后的Ct 值基本不变，故此方法可用于市售灭活疫苗的支原体含量检测。

图4 灭活前后的支原体Ct 值

将抗原含量为108CCU/mL 的支原体10 倍倍比稀释9 个梯度，选取10-4～10-9稀释度，分别取200 μL 提取基因组，用引物SX4 进行荧光定量PCR 扩增，对每个稀释度基因组做3 个重复，且做阴性对照，所得结果以支原体CCU 的对数值为横坐标，对应的Ct 平均值为纵坐标绘制标准曲线，得出标准曲线回归方程为y= -3.658x+ 47.012，式中y为Ct 值，x为支原体CCU 的对数值，R2=0.997 2（图5），表明标准曲线Ct 值和支原体CCU 间呈现良好的线性关系。

图5 不同CCU 支原体的荧光定量扩增及所得Ct 值与支原体CCU 标准曲线分析结果

2.4 引物稳定性试验

用上述建立的荧光定量PCR 方法检测3 份（样本A、B、C）已知CCU 的Mhp 原液（经倍比稀释法测定），判断建立方法的准确性。已知样本A、B、C 的支原体抗原含量分别为108、107、106CCU/mL（图6）。取样本A、B、C 各200 μL 提取基因组，以此基因组为模板进行荧光定量PCR 扩增，测定其Ct 平均值为分别为17.80、21.44、25.10（图7），将其代入标准曲线公式，计算所得对应支原体抗原含量分别为9.68×107、9.79×106、9.77×105CCU/mL（表2）。检测结果与实际含量的变异系数分别0.016 3、0.010 6、0.011 6，说明运用该方法的Ct 值能准确得出对应Mhp 的CCU。

图6 3 种已知样本的抗原含量

图7 不同CCU 支原体样本的两次荧光定量PCR 扩增结果

2.5 该方法测定工艺生产和市售Mhp 疫苗抗原含量

将疫苗工艺生产中的Mhp 菌液提取基因组DNA 进行荧光定量检测，结果Ct 值为14.22（图8），将其代入标准曲线公式，可得Mhp 抗原含量为9.12×108CCU/mL。采用倍比稀释法测定抗原含量为1.0×109CCU/mL（图9）。两种方法所得结果基本一致，进一步说明本研究建立的标准曲线成立，可更快捷地得出对应的CCU。

图8 疫苗生产中的CCU 荧光定量测定结果

图9 疫苗生产中的CCU 倍比稀释法测定结果

选择4 种市售Mhp 灭活疫苗，分别标注为1～4，其疫苗瓶上标注菌量分别为8.0×107、2.5×108、2.5×108、8.0×107CCU/mL。 通过本研究的荧光定量方法测定250 μL（体积比，抗原:佐剂 = 4:1）相应疫苗的菌量分别为6.43×107、9.04×107、7.87×107和5.56×107CCU/mL（图10、表3）。此方法检测所得菌量与市售疫苗标注菌量差异小于1 个数量级，而实际生产应用中的菌量测定通常采用CCU 法，肉眼观察误差可达1 个数量级，因此该方法可用于实际生产中的菌量检测。

图10 用本研究方法检验疫苗样品中的抗原含量结果

表3 4 种商业疫苗试验所得菌含量与瓶标菌量比较结果

3 讨论

疫苗的免疫效果受菌（毒）株、佐剂类型等因素影响，然而病原含量即抗原含量是影响疫苗效价的关键因素[13-14]。疫苗的CCU 是评判疫苗质量的重要标准，但是目前临床上对市售疫苗抗原量的评估存在难点，如注射疫苗后猪体内的Mhp 抗体含量与疫苗菌量没有相关性，并且临床所认可的血清学检测方法无法区分Mhp 抗体是来自自然感染还是疫苗免疫，不适用于个体动物的诊断，因此根据个体动物免疫后Mhp 抗体水平评定疫苗是否合格并不十分可靠[15-17]。而荧光定量PCR 检测技术因其高敏感性和特异性在Mhp 检测中发展迅速[18]。目前，荧光定量PCR 方法进行Mhp 检测的靶基因主要包括16S rRNA、P110、P97和P46[19]。丁敏[20]应用CCU 检测法、浊度法和荧光定量PCR 检测方法，对Mhp 的生长曲线进行研究，发现在Mhp 培养过程中，荧光定量PCR 检测法与浊度法检测结果一直高度相关，培养54 h 内，荧光定量PCR 检测法与CCU 法结果差异无统计学意义（P＜0.05）。Marois 等[21]建立了以P46、P97和P102为靶基因的三重实时荧光定量PCR 方法，将其用于检测诱发SPF 猪支原体肺炎的Mhp 最小菌量。本研究建立了一种荧光定量检测Mhp 菌量的方法，可通过荧光定量检测Ct 值计算出抗原含量，与现有评估手段相比简化了试验流程[22]，有助于提高生产中的检测效率。

本研究首先利用Mhp 国标引物MHP-F 和MHP-R（GB/T 35909—2018），以提取的支原体全基因组为模板进行PCR 扩增，将回收的PCR 产物与T 载体（PMD18-T）直接连接，转化至DH5α后涂于相应抗性平板，筛选阳性克隆后将测序正确的质粒作为内参质粒。根据支原体国标引物所扩片段序列设计4 对荧光定量特异性引物，通过灵敏度和扩增曲线拟合度筛查出引物SX4 敏感性最佳，为4.9×101copies/μL。通过特异性检测，发现引物SX4 对PPV、PCV2、PRV、HPS4 及SS2 都没有扩增，说明引物SX4 特异性良好。绘制该引物标准曲线，发现标准曲线Ct 值和支原体CCU 间呈现良好的线性关系。通过检测培养至不同状态的Mhp 含量发现，该方法与传统CCU 方法相比较，其CCU 数值是一致的，也验证了本研究建立方法的可行性与准确性。

基于Mhp 疫苗生产和临床使用实际，本研究利用该方法检测Mhp 疫苗生产过程及市售疫苗中的菌量，证实此方法可以作为疫苗生产过程中的菌量检测方法，并可节省人力、物力和时间成本。在市售疫苗菌量检测中，该方法测得数据与说明书标注数据差异均小于1 个数量级，但其中一份市售疫苗的检测菌量与标注菌量相差较大（较标注菌量低约2.2倍），除怀疑该疫苗的标注菌量与实际不符外，也说明在后续研究中需对该检测方法进一步优化。