副猪嗜血杆菌AfuA-ELISA 抗体检测方法的建立与应用

李真亚，赵晓康，杨红玉，李 允，孔嫄嫄，贾荣玲，李生涛

（南阳农业职业学院，河南南阳 473000）

副猪嗜血杆菌（Haemophilusparasuis，HPS）是属于巴氏杆菌科嗜血杆菌属的一种革兰氏阴性菌，是猪呼吸道疾病的一种病原体[1-2]。它能定殖于健康猪的上呼吸道，是猪常见的呼吸道共生菌[3-4]。在发病情况下，HPS 可导致以多发性浆膜炎、脑膜炎、关节炎为特征的猪Glasser's 病[5-7]。该病主要发生于5～8 周龄仔猪。目前，副猪嗜血杆菌病已在全球范围内造成了严重经济损失[8-9]。

猪副猪嗜血杆菌病传统的诊断方法主要包括病死猪尸体剖解和细菌分离鉴定。然而，由于HPS生长高度依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）且对营养要求严格，其体外培养非常困难。HPS 分离过程易受其他细菌污染[10-11]，故从临床病料中成功分离该菌的概率很低。HPS的表型容易发生变异，传统的诊断方法常常导致分型错误[12]。上述因素限制了传统诊断方法的临床应用，为此许多基于血清学的新型诊断方法相继被建立。临床试验[11，13]表明，基于HPS 全菌蛋白建立的血清学方法存在灵敏度和特异性较差等缺点。此外，目前市场上暂无针对该病的国产商业化ELISA 试剂盒，而进口试剂盒价格昂贵，无法满足大批量检测需求。因此，亟需建立一种特异性强、灵敏度高且能大规模应用的血清学诊断方法[13-15]。

HbpA、AfuA 是HPS 具有免疫原性的2 个蛋白[16-17]。目前，基于HbpA、AfuA 蛋白建立的ELISA 诊断方法未见报道。本研究拟克隆相关基因并表达HbpA、AfuA 重组蛋白，以这两种蛋白分别作为ELISA 包被抗原，筛选建立一种特异性强、灵敏度高的HPS ELISA 诊断方法，以期用于HPS 抗体检测和疫苗免疫后抗体水平监测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、质粒、血清 HPS SH0165 菌株，由本实验室保存；表达载体pET-28a 以及克隆菌株E.coilDH5α 和BL21，购自TaKaRa 公司；从猪场采集的临床血清以及HPS 阳性、阴性血清，均由本实验室采集制备；猪瘟病毒（CSFV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪链球菌（SS）、猪传染性胸膜肺炎杆菌（APP）、猪肺炎支原体（Mhp）阳性血清，均由华中农业大学陈焕春课题组赠送。

1.1.2 主要试剂及仪器 常用的限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、IPTG、琼脂糖凝胶电泳上样缓冲液、SDS-PAGE 蛋白胶Marker、DNA 电泳Marker、Probest DNA 聚合酶等，均购自TaKaRa公司；DNA 提取试剂盒、质粒小提试剂盒、琼脂糖凝胶快速回收试剂盒，购自OMEGA 公司；羊抗猪二抗、显色液及终止液，均来自武汉科前生物股份有限公司；进口HPS 间接ELISA 试剂盒（简称商业化试剂盒），购自加拿大Biovet 公司；过硫酸铵、TEMED、聚丙烯酰胺，购自BIOSHARP公司。

1.1.3 引物 以HPS SH0165 菌株（GenBank 登录号CP001321.1）为参考菌株，从NCBI 上获取其HbpA、AfuA基因序列，运用Primer 5.0 软件对其全长基因进行引物设计，引物均由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成，引物信息见表1。

表1 PCR 扩增所用引物序列

1.2 重组质粒构建

以SH0165 株基因组为模板，对HbpA、AfuA基因片段进行PCR 扩增。扩增程序：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，循环28 次；最后72 ℃延伸10 min。对回收后的扩增产物和pET-28a 载体进行双酶切，以T4 DNA 连接酶连接酶切产物，将产物转化至DH5α 感受态细胞，然后均匀涂布于含有卡那霉素（50 ng/μL）的LB平板，最后以PCR 和酶切分别鉴定重组质粒，将阳性克隆送测序。

1.3 重组蛋白表达与纯化

将经测序鉴定正确的重组质粒pET28a-HbpA、pET28a-AfuA分别转化至BL21感受态细胞，涂板后挑取单个菌落于37 ℃过夜培养；待菌液扩大培养至OD600nm约为0.6～1.0 时，加入IPTG（0.1 mmol/L）37 ℃诱导表达3.5～4.0 h；诱导结束后，10 000 r/min，离心5 min，将菌体沉淀以PBS洗涤3 次，最后用PBS 重悬；以1 000 bar 高压破碎菌液2～3 次至其澄清明亮，将破碎后的菌液在4 ℃下离心5 min（10 000 r/min），弃上清，获得包涵体沉淀。

依次使用不同浓度（2、4、6 mol/L）的咪唑对包涵体沉淀进行重悬，随后将重悬液4 ℃10 000 r/min，离心5 min，收集上清进行SDSPAGE 电泳和考马斯亮蓝染色，收集纯化后的重组蛋白（rHbpA、rAfuA），使用BCA 试剂盒检测蛋白质量浓度，于-80 ℃冻存。

1.4 间接ELISA 抗原选择

分别以2 μg/mL 的rHbpA 和rAfuA 蛋白包被酶标板，对30 份阴阳性参考血清进行检测，选取效果最佳的蛋白。间接ELISA 按照常规方法操作[13-14]。

1.5 AfuA 间接ELISA（AfuA-ELISA）方法建立

采用矩阵滴定试验方法，优化抗原包被质量浓度、最佳封闭液、样品稀释度、最佳样品稀释液、样品反应时间、二抗稀释液、二抗工作浓度、二抗反应时间和底物反应时间等，根据OD 值和P/N值建立间接ELISA 方法。

统计以试制的AfuA-ELISA 抗体检测试剂盒检测60 份阴性血清的结果，采用阴性样品平均值±3 标准差法（X± 3SD），确定ELISA 抗体检测方法的阴阳性临界值。

1.6 特异性与敏感性试验

选择CSFV、PRRSV、PRV、SS、APP、Mhp阳性血清进行间接ELISA 试验，评估本方法的特异性。将HPS 阳性血清按照1:20、1:40、1:80、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1 000 等8 个稀释度进行稀释，以AfuA-ELISA 方法进行检测，评估其敏感性。

1.7 临床血清检测及其与商业化试剂盒比较

以本研究建立的AfuA-ELISA 方法和商业化试剂盒，分别检测300 份临床血清，比较二者的符合率。

2 结果

2.1 重组质粒构建

经PCR 扩增，获得了与HbpA、AfuA基因预期大小一致的目的片段，在电泳图中可见大小分别为1 596、1 041 bp 的目的条带（图1-A）。对获得的阳性重组质粒进行双酶切鉴定，发现PET28a-HbpA 质粒双酶切后获得了约5 000 和1 596 bp 的2 条条带，PET28a-AfuA 质粒酶切后获得了约5 000 和1 401 bp 的2 条条带（图1-B）。

图1 HbpA、AfuA 基因PCR 扩增及重组质粒构建结果

2.2 重组蛋白表达及纯化

SDS-PAGE 分析结果（图2）显示，成功表达出rHbpA、rAfuA 重组蛋白。在37 ℃条件下，以0.8 mmol/L 的IPTG 诱导剂诱导菌液4～5 h 后，2种重组蛋白均以包涵体形式存在于超声破碎后的沉淀中；经纯化，获得了与预期大小一致的目的蛋白，分别为59、38 kD。

图2 HbpA、AfuA 重组蛋白表达及纯化结果

2.3 最优包被蛋白确定

分别使用2 μg/mL 的rHbpA、rAfuA 重组蛋白包被酶标板，对30 份阴阳性参考血清进行检测。结果（图3）显示，以rAfuA 作为包被蛋白时，OD630nm检测值可以明显区分出阴阳性血清，而rHbpA 不可以。因此，选择rAfuA 重组蛋白作为间接ELISA 包被抗原。

图3 最优包被抗原筛选结果

2.4 AfuA-ELISA 方法建立

以rAfuA 蛋白包被酶标板进行条件优化，根据OD630nm和P/N值确定最佳抗原包被质量浓度为5 μg/mL，最佳封闭液为5%脱脂乳溶液，最佳样品稀释液为2% BSA 溶液，最佳样品孵育时间为30 min，最佳样品稀释度为1:25，最佳酶标二抗稀释度为1:20 000，最佳酶标二抗孵育时间为30 min，最佳底物孵育时间为10 min。

根据已优化的条件，对60 份阴性血清进行检测。阴性样品的X± 3SD 计算为0.35，选择该OD 值作为临界值，即当OD630nm≥0.35 时，判定为HPS 抗体阳性，当OD630nm＜0.35 时，判定为HPS 抗体阴性。

2.5 特异性、敏感性试验

以CSFV、PRRSV、PRV、SS、APP、Mhp 阳性血清作为待检血清，使用AfuA-ELISA 方法进行检测，发现6 种血清均被检测为HPS 阴性（图4），提示该方法特异性良好。当标准阳性血清以1:400稀释时，仍可被检测为阳性，表明本试剂盒敏感性较高。

图4 特异性试验结果

2.6 临床血清检测

使用本研究建立的AfuA-ELISA 方法与商业化试剂盒，分别对300 份临床样品进行检测。结果（表2）显示，AfuA-ELISA 方法检出阳性血清177 份，商业化试剂盒检出阳性血清180 份，阳性符合率为90.0%（162/180）；AfuA-ELISA 方法检出阴性血清123 份，商业化试剂盒检出阴性血清120 份，阴性符合率为87.5%（105/120），二者总体符合率为89.0%（267/300）。

表2 AfuA-ELISA 方法与商业化试剂盒符合率比较结果单位：份

3 讨论

3.1 HPS 血清学诊断方法研究进展

基于抗体和抗原相结合的血清学诊断方法具有灵敏度高、特异性强，能高通量操作的优点，在疾病诊断方面扮演着重要角色。目前，针对HPS的血清学诊断方法主要包括补体结合试验（CFT），间接血凝试验（IHA）和ELISA。采用CFT 方法，HPS 感染抗体在急性期（1 周内）可以被检测到，但是其在HPS 多种血清型之间具有交叉反应[18]。Takahashi 等[19]运用CFT 评估疫苗免疫后血清抗体的效价情况，但没有评估其交叉反应性。IHA 中，以HPS 菌体超声破碎后的上清或者煮沸裂解的菌体作为包被抗原，吸附于绵羊红细胞上检测特异性抗体。但是利用该方法检测猪免疫抗体时，仍然出现阴性结果，因此其不能作为猪免疫抗体的检测方法[20]。传统的HPS ELISA 方法主要以细菌荚膜、多糖以及破碎的全菌菌体作为包被抗原。刘娜等[21]报道称荚膜和脂多糖是细菌中最为保守的成分，但是传统HPS ELISA 方法大多面临特异性低的问题，其在临床检测中假阳性很高。随着对HPS病原学研究的不断深入，许多新的、关键的保守毒力因子被发现。基于这些毒力因子衍生出两个研究方向：一是构建HPS 弱毒疫苗，二是建立基于这些毒力基因的诊断方法。例如：陈善真等[22]建立了基于Omp5 蛋白的ELISA 方法；朱晓凯[23]运用双向电泳的方法对HPS 外膜蛋白进行筛选，获得了特异性强的D15 蛋白，并建立了基于D15 蛋白的ELISA 方法，其具有良好的特异性和灵敏度，与临床阳性样本的总体符合率达到88.3%；朱晓明等[24]建立了基于超氧化物歧化酶蛋白（MSD）的ELISA 方法；王雷[25]建立了基于Omp5、CDTA、CDTB、CDTC 4 种混合蛋白的ELISA 方法。然而，这些已经报道建立的ELISA方法还未商业化应用，不能满足HPS 检测的临床需求。

3.2 AfuA-ELISA 检测方法的建立

目前已建立的ELISA 方法多采用细菌脂多糖和外膜蛋白作为包被抗原，但是试验证明脂多糖和外膜蛋白均易与其他细菌血清发生交叉反应。OppA 蛋白作为ABC 传输器家族的主要成员，是具有免疫原性的保守蛋白[26-29]。车勇良等[30]建立了基于OppA 蛋白的ELISA 方法，其具有良好的灵敏度和特异性。本试验前期克隆表达了OppA蛋白，在进行最优蛋白筛选时，发现其免疫原性略低于细胞毒性膨胀蛋白B（CdtB），因此其作为ELISA 诊断靶标的成熟性还需要进一步研究。CdtB 也是HPS 重要的免疫原性蛋白和毒力因子，刘双红[31]、Elwell 等[32]建立了基于CdtB 蛋白的ELISA 方法。然而，本实验室前期研究结果表明，CdtB-ELISA 法对大肠杆菌的检测结果为阳性，推测可能是该方法以大肠杆菌作为CdtB 蛋白的表达系统，CdtB 蛋白中混有大肠杆菌成分。因此当选择大肠杆菌作为蛋白表达系统时，CdtB 不是最优包被蛋白。

HbpA、AfuA 作为HPS 2 个具有免疫原性的蛋白，目前还没有基于二者建立ELISA 方法的报道。HbpA 蛋白可以结合宿主体内各种形式的血红蛋白从而摄取铁离子，维持HPS 自身存活。文心田等[17]构建了基于HbpA 的HPS 重组亚单位疫苗，免疫后猪能产生高水平的HbpA 特异性抗体。张鹏云等[15]基于HbpA 建立了间接ELISA 方法，其对阴阳性血清不具有明显的区分度，故在筛选最优包被蛋白时将HbpA 排除，这与本研究结果一致。本研究中，分别使用2 μg/mL 的rHbpA、rAfuA 蛋白包被酶标板，检测30 份阴阳性参考血清，结果发现rAfuA 蛋白检测的OD630nm可明显区分阴阳性血清，而rHbpA 不明显，故选择rAfuA 作为最优包被蛋白。AfuA 作为ABC 传输器家族的重要成员，在维持HPS 对铁离子的摄取和转运方面起着重要作用，是一种新发现的免疫原性蛋白。免疫AfuA蛋白后产生的抗体对小鼠感染HPS 能提供有效保护[16]。以rAfuA 重组蛋白包被酶标板进行条件优化，根据OD 和P/N值确定了各项最佳反应参数。随后，对所建立方法的灵敏度进行了评估，结果显示，标准阳性血清稀释至1:400，仍可被检测为阳性，表明其具有很高的灵敏度。在临床应用研究中，以AfuA-ELISA 方法对300 份临床血清样本进行检测，分别检出阳性、阴性血清177、123 份，与商业化试剂盒阳性、阴性符合率分别为90.0%、87.5%，总体符合率为89.0%。并且，该方法对猪其他常见病原的阳性血清检测结果也均为阴性，提示其具有较强的特异性。

4 结论与展望

本研究重组表达了HPS 2 个具有免疫原性的蛋白，即HbpA 和AfuA。通过对二者进行初筛，确定将AfuA 作为最佳包被蛋白并优化了反应条件，建立了间接AfuA-ELISA 检测方法。该方法特异性强、灵敏度高，与商业化试剂盒符合率高，可用于临床HPS 抗体检测。下一步，将选择合作猪场对试制的试剂盒进行试用，收集临床数据，为进一步申报新兽药奠定基础。