人参发酵产物中总皂苷的纯化研究

杨林锦,杜丽霞,宋国强,郭远达,金宇昕,姜丽娇,田 健

(1.长春中医药大学,吉林 长春 130117;2.吉林省一汽总医院,吉林 长春 130013)

人参(PanaxginsengC.A.Mey.),是吉林省道地药材,五加科人参的干燥根和根茎[1],可补元气,安神,益脾,益肺,益智,生津[2]。人参发酵产物是采用人参根为君药,经过发酵后而得到的一种药物。经发酵,人参有效成分中的稀有皂苷含量大大增加[3-5]。稀有皂苷对肿瘤、不同种类的癌症有明显的治疗和抑制作用[6-9],对肿瘤术后复发和转移预防有借鉴作用,可用于辅助治疗肿瘤。本实验以人参发酵产物为研究对象研究人参总皂苷成分的提纯过程。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

标准品(人参皂苷Re),中国药品生物制品鉴定所;人参药材购于长春市宏检大药房,经翁丽丽教授(长春中医药大学)鉴定;D101、AB-8、DM130、X-5、HPD100、HP20型大孔吸附树脂(河北沧州宝恩化工有限公司);实验所用液体试剂全部为分析纯、固体试剂为化学纯、水为纯净水。

万分之一电子天平EL204,METTLER TOLEDO;十万分之一电子天平AB135-S,METTLER TOLEDO;TU-1810系列紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;SORVALL Evolution离心机,Kendro Laboratory 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 人参总皂苷的含量测定

1.2.1.1 对照品人参总皂苷Re溶液的制备

精密称取人参皂苷Re 5 mg,置于25 mL容量瓶中,加入适量甲醇溶化后,稀释定容至刻度线,摇匀即得0.200 4 mg/mL的Re溶液。

1.2.1.2 供试品溶液制备

精密称取研细的人参发酵产物提取物1 g,置于25 mL容量瓶中,加入适量蒸馏水后,超声后放置阴凉处冷却,再加入蒸馏水,定容至刻度,摇匀,以等量水饱和正丁醇溶液,分4次萃取,干燥,即得。取干燥后的供试品置于50 mL的量瓶内,加入适量甲醇溶液至刻线,摇匀。再从中精密吸取1 mL的续滤液置于10 mL容量瓶中,用甲醇将滤液定容到刻线上,并摇匀。

1.2.1.3 最大吸收波长的选择

分别精密地吸取1 mL对照物溶液和0.1 mL供试品溶液,置于具塞试管内,低温挥发溶剂,加入5%香草醛高氯酸溶液0.5 mL,立即摇晃,即成。在60 ℃水浴中加热15 min,然后放入冰水中立即冷却,加入77%的5 mL硫酸溶液,摇晃均匀即可。使用相应试剂作为空白溶液。

波长300～700 nm范围内光谱扫描。人参皂苷Re对照品和供试品在540 nm处吸收峰最大,因此选择其作为测定波长。

1.2.2 大孔树脂纯化工艺优选

根据《中国药典》人参总皂苷项下的提纯方法及文献报道,人参中的有效成分主要是人参皂苷类成分,而人参皂苷成分提纯大多采用的是大孔树脂吸附。大孔树脂吸附性能各型号不同[10-15]。本文选取了D101、HP20、AB-8、X-5、DM130、HPD100的树脂进行考察。

1.2.2.1 大孔树脂预处理方法

在适量的95%乙醇中分别加入6种不同型号未经处理的大孔树脂,浸泡24 h,使之充分溶胀。湿法装柱,用95%乙醇冲洗。向蒸馏水中加入待流出的95%乙醇溶液,当蒸馏水中不再呈现白色混浊液后,用蒸馏水将其冲至没有乙醇味的状态。用5%的盐酸溶液浸泡4 h,以5 BV/h的流速经大孔树脂,用蒸馏水冲至中性;然后再用2%氢氧化钠溶液浸泡4 h,以同样的流速通过树脂,用蒸馏水冲至中性后,在水中浸泡。最后将以上处理过的树脂保存在95%的乙醇溶液中备后续使用。

1.2.2.2 最大吸附量和静态解析率

用滤纸吸干其大孔树脂表面的水分,分别称取10.0 g预处理后不同型号的树脂各两份。其中一份放置有塞的锥形瓶中,精密地加入质量浓度为20.31 mg/mL的人参发酵产物提取液25 mL。浸泡6 h,每隔30 min左右振荡一次,搅拌60 s,再静置吸附24 h。过滤后,按总皂苷含量测定方法,测定其吸光度。另一份树脂自然晾干后称重,求滤液中皂苷的总含量及其饱和吸附量Qe。

Qe=(c0-c1)V/m,

其中,c0、c1为分析物的初始浓度和平衡浓度,V为吸附体积,m为树脂质量。

将100 mL 70%乙醇,加入水洗后的饱和吸附树脂中,在常温条件下,浸泡2 h,每隔10 min摇动60 s,滤过。按总皂苷含量测定静态解析率D。

D=(cdVd/Qe)×100%,

其中,cd为解析液浓度,Vd为解析液体积。

1.2.2.3 提取液上样浓度选择

取3份处理妥当的树脂。另取3份不同浓度发酵产物提取液,分别上柱。先用上样速度2 BV/h,吸附1 h。然后将杂质用蒸馏水洗去,再将有效成分用5 BV的70%乙醇溶液洗去,最后以4 BV/h的速度洗去。旋蒸回收后测定。

1.2.2.4 提取液上样pH值(酸碱度)选择

取D101型号25 g的大孔树脂,采用湿法填充后,取4份相同浓度的人参发酵产物提取液,将其酸碱度分别调整为3.5(原液酸碱度)、5、7,9,先用2 BV/h的上样速度吸附1 h。按前面方法洗去杂质,洗去有效成分。乙醇回收后测定。

1.2.2.5 上样液上样速度考察

取处理妥当的D101大孔树脂25 g。湿法装柱。取质量浓度0.8 g/mL的人参发酵产物提取液3份,采用不同速度上样,吸附1 h。按前面方法洗去杂质,洗去有效成分。乙醇回收后测定。

1.2.2.6 样液吸附时间考察

取处理妥当的D101大孔树脂25 g,湿法填装。取质量浓度0.8 g/mL的人参发酵产物提取液3份,上样速度为2 BV/h。上样后,分别静置不同时间,再按前面方法洗去杂质,洗去有效成分。乙醇回收后测定。

1.2.2.7 洗脱剂种类考察

取处理妥当的D101大孔树脂25 g,湿法填装。取质量浓度0.8 g/mL的人参发酵产物提取液3份,上样速度为2 BV/h上样,静置吸附1 h,按前面方法洗去杂质,再分别用不同浓度乙醇,洗去有效成分。再进行乙醇回收,然后进行测定。

1.3 工艺验证

采用湿法装柱的25 g D101大孔树脂进行适当处理,取质量浓度0.8 g/mL的人参发酵产物提取液3份,上样速度为2 BV/h,静置吸附1 h,用蒸馏水洗去未吸附杂质,再用75%乙醇溶液洗去有效成分,将乙醇浸出液分别收集后测定。

2 结果分析

2.1 标准曲线绘制

精准量取人参皂苷Re对照品0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.2 mL溶液,在540 nm处测定吸光度,同上法显色。取对照品人参皂苷Re溶液的质量浓度为横坐标,以其吸光度的值为纵坐标求得回归方程:Y=0.011 32X-0.002 9,r=0.999 9。在7.287～80.160 μg/mL的范围内,人参皂苷Re的线性关系较好。

2.2 最大吸附量和静态解析率

6种不同型号的大孔树脂的饱和吸附量和静态解析率考察结果见表1。

表1 6种不同型号的大孔树脂的饱和吸附量和静态解析率结果

从表1可以看出,在解析率上,虽然DM130型和HPD100型树脂比D101型稍大一些,但是三者之间并没有太大的差别。但在静态吸附量上,D101的大孔树脂明显高于其他型号,因此在人参总皂苷提取物的纯化树脂中选用了D101的大孔树脂。

2.3 提取液上样浓度选择

选用不同浓度的人参发酵产物提取液上样的结果见表2。

表2 提取液的上柱浓度考察结果表

根据表2,选择上样液质量浓度定为0.8 g/L时,测得洗脱液中总皂苷的含量最高。选择0.8 g/mL为最优的上样质量浓度。

2.4 提取液上样pH值选择

对人参发酵产物提取液的pH值进行调节后上样,结果见表3。

表3 提取液上柱pH考察结果

根据表3,原液与pH呈中性时的提取液比较,两者的总皂苷含量相似,而更适合大生产的是不用调节酸碱度的原液。

2.5 上样液上样速度考察

在人参发酵产物提取液上样时采用不同的上样速度,结果见表4。根据表4看出,上样速度为2 BV/h,洗脱液中皂苷的含量最佳。

表4 提取液上样速度考察结果表

2.6 上样液吸附时间考察

人参发酵产物提取液上样后,分别静置不同时间进行吸附,结果见表5。根据表5,总皂苷在不同吸附时间内的吸附量相差不大,最好的条件是选短1 h的上样吸附时间。

表5 提取液上样液吸附时间的考察结果

2.7 洗脱剂种类考察

经前期实验确定乙醇为最适洗脱溶剂,不同体积分数的乙醇溶液洗脱人参发酵产物提取物中总皂苷的结果见表6。根据表6,有效成分从75%的乙醇中洗脱得到的皂苷的量是最高的。

表6 洗脱剂的种类的考察结果

2.8 验证实验

在上述优选的工艺条件下,采用D101型大孔树脂对人参发酵产物提取物,分别进行平行实验3次,结果见表7。根据表7,人参发酵产物总皂苷经过D101型大孔树脂纯化,其工艺具有稳定性和可行性。

表7 大孔树脂纯化总皂苷验证实验结果

3 结论

本研究将6种大孔吸附树脂对人参发酵产物总皂苷的吸附和解吸性能进行比较,考察上样液质量浓度、上样速度、吸附时间等因素对提纯效果的影响。显示D101树脂分离纯化效果最佳。取处理妥当的D101大孔树脂,湿法填装,0.8 g/mL的人参发酵产物提取原液上样,上样速度为2 BV/h,吸附1 h,水溶性杂质先用蒸馏水洗去,再用5BV的75%乙醇溶液洗去,收集洗脱液,回收乙醇,干燥并粉碎。纯化工艺稳定可靠,为后续人参发酵产物不同剂型的制备工艺研究提供理论参考。