纳米罗勒精油/聚乙烯吡咯烷酮-聚乙烯醇水凝胶伤口敷料制备及性能表征

徐密,张良*,何志仙

（1.西安建筑科技大学 化学与化工学院，西安 710311；2.西安建筑科技大学 分析测试中心，西安 710311）

伤口敷料作为伤口保护屏障，能防止细菌感染并帮助伤口愈合[1]。理想的伤口敷料材料应具备良好的生物相容、抑菌、力学、保湿、溶胀、低黏附、透气等性能，其中抑菌性能是关键[2-3]。为了赋予伤口敷料良好的抑菌性，引入了一系列抑菌剂，如抗生素、金属和金属氧化物，虽然它们具有良好的抑菌活性，但其安全和环保一直存在争议[4-7]。罗勒是一种芳香草本植物，传统上用于烹饪、民间医学、制药和食品工业，可以从其叶片中提取罗勒精油(BEO)，其中含有多种醇、酚类和烯烃，对大量致病菌的抗菌活性已被一些研究证实，是一种绿色、安全、环保且可再生的抑菌剂[8-9]。然而，BEO直接用于伤口治疗面临一些挑战，包括它们的高挥发性及直接暴露在空间时变质的高风险，因此不能在较长时间内维持抑菌效果[10]。纳米封装已被提议作为克服精油以上问题的新方法[11]。通过封装制备的聚合物纳米粒子，如纳米胶囊和纳米球，可以控制精油的释放，提高精油的物理稳定性和抑菌能力，并降低精油的挥发性[12]。纳米沉淀是最简单和可重复的封装方法[13]。玉米醇溶蛋白(Zein)是一种从玉米中提取的两亲性蛋白质，不溶于水和无水乙醇，而溶于80%～92%的乙醇，具有良好的生物相容性，常用于封装生物活性纳米粒子[14]。

聚合物纳米粒子单独用于伤口愈合时，往往不能有效地支撑或保护伤口，因此需要合适的材料对其进行负载，具有三维网络结构的水凝胶则被认为是良好的伤口敷料基材[15]。聚乙烯醇(PVA)是一种合成、生物相容、可降解、亲水聚合物[16]。PVA独特的半晶体结构使可以通过冷冻/解冻方法制备水凝胶，避免了化学交联剂的引入，从而降低了水凝胶的毒性[17]。PVA基水凝胶具有类软组织含水量，可以在治疗过程中控制活性物质的释放，加速皮肤伤口的愈合，在伤口敷料方面有很大潜力[18]。然而，作为伤口敷料需要进一步提高其力学性和抑菌性，因此通常制备基于PVA的杂化水凝胶[19]。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)表现出良好的生物相容性和生物降解性、高水溶性、优异的润湿性和成膜性[20]。研究表明，PVP-PVA基水凝胶具有良好的物理性能，适合伤口敷料，并且能屏蔽细菌[21-23]。

在本工作中，首先通过纳米沉淀法制备了具有核壳结构的纳米罗勒精油(BEO@Zein)，然后通过冻融循环法制备了纳米罗勒精油/聚乙烯吡咯烷酮-聚乙烯醇(BEO@Zein/PVP-PVA)水凝胶伤口敷料。对BEO@Zein和BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶进行表征，测试了水凝胶的抑菌性能及挥发性、力学性、溶胀性、保湿性、降解性和血液相容性。

1 实验材料及方法

1.1 原材料

罗勒精油(BEO)、玉米醇溶蛋白(Zein，92%)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP，相对分子质量MW=40 000)，上海源叶生物；聚乙烯醇(PVA，MW=105 000)，广东光华科技；无水乙醇(分析纯)，天津市富宇精细化工；磷酸盐缓冲液(PBS，1X，pH=7.2～7.4)，上海泰坦科技；去离子水为实验室自制。

1.2 样品的制备

1.2.1 BEO@Zein的制备

在4.8wt%Zein的乙醇水溶液(乙醇与水的体积比为4∶1)中加入BEO (BEO和Zein的质量比为5∶1)，在剧烈搅拌下把上述混合溶液倒入其3倍体积的水中，得到BEO@Zein悬浮液。通过静置挥发除去乙醇和部分水，把悬浮液浓缩为原体积的1/4。一部分悬浮液冷冻干燥为粉末保存，一部分以悬浮液状态在4℃下保存。

在不加入BEO的条件下可以制备纳米Zein(BEO和Zein的质量比为0∶1)，方法同上。

1.2.2 BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的制备

15wt%PVA水溶液中加入PVP (PVA和PVP的质量比为5∶1)，90℃下搅拌1 h后降为室温，然后一边搅拌混合溶液一边加入BEO@Zein悬浮液(混合溶液与悬浮液的体积比为5.67∶5)，搅拌均匀后转移至6孔培养皿，冻融循环至少3次。记作BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶。

15wt%PVA和8.5wt%PVA水溶液中分别加入PVP (PVA和PVP的质量比为5∶1)，超声10 min除去内部气泡，转移至6孔培养皿，冻融循环至少3次。分别记作PVP-PVA水凝胶和PVP-8.5wt%PVA水凝胶。

15wt%PVA和8.5wt%PVA水溶液分别在90℃下搅拌1 h，超声10 min除去内部气泡，转移至6孔培养皿，冻融循环至少3次。分别记作PVA水凝胶和8.5wt%PVA水凝胶。

1.3 样品的表征

1.3.1 BEO@Zein的表征

通过扫描电镜(SEM，GeminiSEM500，卡尔蔡司(上海)管理有限公司，电压5 kV)观察纳米BEO@Zein的形貌。通过负染色技术分析纳米Zein和BEO@Zein的结构，磷钨酸负染色后进行透射电镜(TEM，Hitachi H-7650，日立公司，120 kV)检测成像。

1.3.2 BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的表征

通过SEM (Hitachi Regulus8100，日立公司，电压5 kV)观察PVA水凝胶、PVP-PVA水凝胶、BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的形貌。通过X射线衍射仪(XRD，Rigaku Ultma IV，日本理学)分析PVA水凝胶、PVP-PVA水凝胶、BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶在5°～90°的结晶性。通过热重红外联用仪(ISQ 7000 Nicolet iS50 TGA/DSC3，新加坡THERMO公司)分析BEO、BEO@Zein、BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶、PVP-PVA水凝胶、PVA水凝胶在500～4 000 cm-1范围内的红外图谱(FTIR)，并测试BEO、Zein、BEO@Zein、BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶在50～600℃范围内的差式扫描量热法(DSC)曲线和热重(TG)曲线(氮气气氛，升温速率10℃/min)。

1.4 性能测试

1.4.1 抑菌性能

(1) 探究BEO的挥发性及其对BEO@Zein/PVPPVA水凝胶抑菌性的影响。

首先，测定了等质量的BEO、BEO@Zein随着时间在37℃空气中的质量变化，挥发率(%)计算方式如下：

其中：M0是挥发前的质量；Mt是挥发后的质量。每组样品平行重复3次。

然后，采用抑菌圈法对分别挥发了36 h和72 h的BEO (以滤纸为载体)、BEO@Zein/PVPPVA水凝胶进行抑菌实验。把挥发了一段时间的BEO和水凝胶分别放在涂有大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)悬浮液的固体平板培养基中心，放在生化恒温箱(37℃)中培养，24 h后测量抑菌圈的尺寸并拍照记录。

(2) 探究BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶在PBS中对BEO的释放规律及对抑菌性能的影响。

首先，把水凝胶置于1 mL PBS中，固定时间间隔后取500 µL溶液，并补充500 µL新鲜PBS。测量溶液在280 nm的吸光度，根据标准曲线得到BEO的含量，并计算BEO释放率(%)，计算方式如下：

其中：E0是水凝胶中BEO总质量；Et是PBS中释放的BEO质量。每组样品平行重复3次。

然后把水凝胶与E.coli和S.aureus于液体培养基中共培养一段时间，在固定时间间隔后取50 µL菌悬液涂布于固体培养基上，37℃培养24 h。

(3) 通过抑菌圈法测试PVP-PVA水凝胶、BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶对E.coli和S.aureus的抑菌性。

(4) 探究BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的抗E.coli生物膜和S.aureus生物膜性能。24孔板中每孔500 µL菌悬液，在37℃培养24 h，弃去形成细菌生物膜的孔板中的悬液，用PBS冲洗3次。把水凝胶和500 µL液体培养基加入各孔，37℃培养24 h。弃去悬液，每孔中加入500 µL PBS，超声振荡10 min，分别在每孔中取50 µL涂布于固体培养基上，37℃培养24 h。每组样品平行重复3次。

(5) 通过热重红外气质联用仪对BEO进行气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析，探究BEO的有效抑菌成分。用乙醇把BEO稀释103倍，进样量为1 µL，分流进样，分流比10∶1，进样口温度220℃，升温程序，初始温度75℃，以5℃/min速率升至150℃，保留2 min，以10℃/min速率升至200℃，保留3 min。

1.4.2 力学性能

把PVA水凝胶、8.5wt%PVA水凝胶、PVP-PVA水凝胶、PVP-8.5wt%PVA水凝胶、BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶裁成20 mm×5 mm (长×宽)的尺寸，使用万能实验机(CMT6103，美特斯工业系统)以50 mm/min的拉伸速度进行实验，测试内容为力-位移曲线、应力-应变曲线、拉伸强度、断裂伸长率、拉伸模量。每组样品平行测量3次。

1.4.3 溶胀性

把PVA水凝胶、PVP-PVA水凝胶、BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶浸泡在PBS溶液中，随着时间的变化，记录水凝胶溶胀前后的质量，溶胀率(%)计算方式如下：

其中：Gt为水凝胶溶胀后的质量；G0为水凝胶溶胀前的质量。每组样品平行重复3次。

1.4.4 保湿性

通过水凝胶的失水率来评价其保湿性。把BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶分别保存在25℃和37℃下，随着时间的变化，记录水凝胶失水前后的质量，失水率(%)计算方式如下：

其中：R0为水凝胶失水前的质量；Rt为水凝胶失水后的质量。每组样品平行重复3次。

1.4.5 降解性

把PVP-PVA水凝胶、BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶埋在自然环境下的土壤中，或浸泡在PBS溶液中，随着时间的变化，记录水凝胶降解前后的干重，降解率(%)计算方式如下：

其中：N0是水凝胶降解前的质量；Nt是水凝胶降解后的质量。每组样品平行重复3次。

1.4.6 血液相容性

用5 mL的0.9wt%氯化钠溶液稀释新鲜抗凝剂全血4 mL，制备稀释后的全血溶液。将BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶样品切成1 cm×1 cm的小块，用蒸馏水和0.9 wt%氯化钠溶液冲洗。放入试管中，加入10 mL的0.9wt%氯化钠溶液。试管在37℃下加热30 min，然后加入0.2 mL稀释的全血，在37℃下加热1 h。1 000 r/min离心10 min后，用酶标仪(INFINITE 200 FRO，特康奥地利有限公司)测定在545 nm处上清液的吸光度。溶血率(%)计算方式如下：

其中：ODsam、ODneg和ODpos分别为BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶样品、阴性对照和阳性对照。每组样品平行重复3次。然后通过倒置荧光显微镜(AXIO，卡尔蔡司有限公司)对BEO@Zein/PVPPVA水凝胶、阴性对照和阳性对照处理的红细胞进行光学图像拍摄。

1.4.7 统计分析

使用Origin软件进行统计分析。结果表示为一式3份测量值的平均值±标准偏差(n=3，显著性水平p≤0.05)。用Studentt检验区分p值。

2 结果与讨论

2.1 BEO@Zein和BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的制备与表征

BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的制备原理如图1所示。在BEO@Zein制备过程中，采用了纳米沉淀法，因此Zein和BEO必须同时溶解在同一溶剂中。因为Zein不溶于水和无水乙醇，而溶于80%～92%的乙醇，且BEO溶于乙醇，所以选择了乙醇和水体积比为4∶1的乙醇水溶液作为溶剂[14]。首先，把BEO与Zein同时溶解在乙醇水溶液中，当水的含量骤然增大时，良好溶剂转变为不良溶剂，BEO与Zein同时析出。两亲性Zein自发形成亲水基团对外、疏水基团对内的空腔结构，疏水的BEO被包裹在疏水空腔内部，因此形成了以BEO为核、Zein为壳的纳米粒子，即BEO@Zein。然后，把BEO@Zein加入水凝胶中，通过冻融循环PVA发生结晶，同时PVA与PVP形成分子间和分子内氢键，由此制备了物理交联的BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶。

图1 罗勒精油(BEO)@玉米醇溶蛋白(Zein)/聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-聚乙烯醇(PVA)水凝胶的制备示意图Fig.1 Schematic diagram of basil essential oil (BEO)@Zein/polyvinylpyrrolidone (PVP)-polyvinyl alcohol (PVA) hydrogel preparation

BEO和Zein的初始比例不同，BEO@Zein的平均粒径有所差异(图2)。当BEO和Zein的质量比为5∶1时，平均粒径相对较小(56.3 nm)。此外，随着BEO的比例增大，BEO@Zein的抑菌性能也有所提高(图3)。但是，当其质量比≥6∶1时，BEO会相对过量，从而影响BEO@Zein的形成和制备，且抑菌性能也不再增强。因此，以BEO和Zein质量比5∶1作为BEO@Zein的初始投料比。

图2 纳米Zein和不同质量比BEO@Zein纳米粒子的平均粒径Fig.2 Average particle size of Zein nanoparticles and BEO@Zein nanoparticles with different mass ratios

图3 纳米Zein和不同质量比的BEO@Zein纳米粒子悬浮液对E.coli和S.aureus的抑菌性Fig.3 Bacteriostasis of Zein nanoparticle suspensions and BEO@Zein nanoparticle suspensions with different mass ratios against E.coli and S.aureus

TEM图像显示，纳米Zein形成了以Zein为壳的空腔(壳密度大、颜色暗，空腔密度小、颜色亮)(图4(a))。基于Zein的两亲性和BEO的疏水性，BEO@Zein形成了以Zein为壳、BEO为核的核壳结构，由于BEO的密度较小，因此核的颜色较亮(接近纳米Zein空腔的颜色)，表明BEO被成功封装(图4(b))。SEM图像则显示，纳米Zein(图4(c))和BEO@Zein(图4(d))都是形状规则的球形颗粒，具有良好的分散性。此外，对BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶进行了表面形貌分析。PVA水凝胶(图4(e))表面有少量的孔，引入PVP后，PVPPVA水凝胶(图4(f))变光滑了，这可能是PVP的成膜性造成的。在PVP-PVA水凝胶中加入BEO@Zein悬浮液后，BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶表面的孔明显增多，且孔径变大，这可能与水凝胶含水量增大有关(图4(g))。BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的多孔结构有利于提高其溶胀性能，帮助吸收伤口渗出物。同时，在更高倍数下观察到BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶表面分布的少量BEO@Zein，其大部分都分散在水凝胶内部(图4(h))。

图4 纳米Zein的TEM (a)和SEM图像(c)；BEO@Zein的TEM (b)和SEM图像(d)；PVA水凝胶(e)、PVP-PVA水凝胶(f)、BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶((g),(h))的SEM图像Fig.4 SEM (a) and TEM (c) images of Zein nanoparticles; SEM (b) and TEM (d) images of BEO@Zein nanoparticles; SEM images of PVA hydrogel (e),PVP-PVA hydrogel (f) and BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel ((g),(h))

为进一步证明BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的制备，对其进行了FTIR图谱(图5(a))分析。BEO在2 970 cm-1处有C-H sp3振动，在1 515 cm-1处有苯环骨架振动。BEO@Zein出现蛋白特征谱带，1 655 cm-1的峰是由酰胺I的C=O振动引起的，1 544 cm-1的峰是由酰胺II的C-N和C-H振动引起的。PVA水凝胶在2 937 cm-1、1 655 cm-1和1 094 cm-1处的峰分别代表C-H、C=O和C-O sp3振动。PVP-PVA水凝胶在1 293 cm-1出现了一个新峰，是PVP的C-N振动引起的，同时在1 655 cm-1的峰偏移到1 652 cm-1且有所增强，可能是由于PVP和PVA的C=O双键振动重叠。BEO@Zein(如-C-H、苯环骨架、酰胺I、酰胺II)和PVP-PVA水凝胶(如C-H、C=O、C=N、C-O)的特征峰在BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的图谱上均有体现，证明了水凝胶的成功制备。此外，在3 336 cm-1处有宽且强的O-H振动峰，表明BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶中形成了氢键。

图5 水凝胶的FTIR图谱(a)、XRD图谱(b) 、DSC曲线(c)和TG曲线(d)Fig.5 FTIR spectra (a),XRD patterns (b),DSC curves (c) and TG curves (d) of hydrogel

对PVA、PVP-PVA和BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶进行了XRD实验，如图5(b)所示，水凝胶在衍射角2θ=19.7°和40.8°有与PVA结晶对应的衍射峰，表明水凝胶中形成了PVA结晶的网络结构[23]。对比不同水凝胶在19.7°处的峰强度，在BEO@Zein加入水凝胶后，峰强度降低了约1/5，说明PVA结晶性有所降低。这可能是由于BEO@Zein的加入降低了水凝胶PVA含量，而PVA含量越低，PVA结晶性越差，水凝胶交联度就越低，相反，PVA含量越高，PVA结晶性越好，水凝胶交联度就越高。因此，PVA结晶性会影响水凝胶的力学性能和降解性。

通过DSC曲线(图5(c))和TG曲线(图5(d))分析了BEO@Zein和BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的热稳定性。在DSC曲线中，BEO在187.52℃有一个吸热峰；Zein在330.76℃有一个吸热峰；BEO@Zein在328.78℃也有一个吸热峰，峰值温度与Zein接近，但是未出现BEO的特征吸热峰，可能是由于核壳结构提高了BEO的热稳定性。BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶在107.87℃有一个与水有关的吸热峰，没有出现BEO的特征吸热峰，这说明水凝胶对BEO也起到了较好的保护作用。在TG曲线中，BEO@Zein有两个失重阶段，第一个阶段13wt%的失重与游离BEO有关，第二个阶段79wt%的失重与Zein和被封装的BEO有关，但是其失重时的温度比纯BEO高，再次证明BEO@Zein可能提高了BEO的热稳定性。BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶也有两个失重阶段，第一阶段主要是水，第二阶段主要是BEO和PVA等分子的分解，但其温度仍比纯BEO高。可见，BEO@Zein的核壳结构和BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶网络都有利于提高BEO的热稳定性。

2.2 BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶缓释抑菌性能和抑菌机制

由于BEO具有较强的挥发性，可能会对抑菌效果产生不利影响，因此首先对BEO及BEO@Zein进行了挥发性测试，结果如图6(a)所示，12 h后，BEO的挥发率为83%，但BEO@Zein的挥发率仅为2%，且之后其挥发率没有明显增大。这明显的差异说明BEO@Zein对BEO的包封可以有效降低它的挥发性。形成BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶后PVP-PVA水凝胶包裹BEO@Zein纳米颗粒，进一步延缓BEO的释放。为了进一步验证BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶对BEO缓释性能，水凝胶在PBS中BEO的释放如图6(b)所示，在前10 h内以较快的速度释放，呈现近乎线性的释放规律，释放率最高达到44%。此后，BEO释放速度减慢，在24 h释放率达到52%。因此，从空气和模拟体液中均可以表明上述材料对BEO释放驱动力主要是浓度梯度扩散控制，而BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶对BEO释放具有减缓功能，其缓释的原因是首先BEO通过BEO@Zein的外层，受到蛋白中氨基和羟基与BEO的氢键作用延缓其扩散速度，然后BEO进入水凝胶后，同样受到水凝胶的氢键作用减缓其扩散。氢键作用在红外的表征中已经得到证实。与没有氢键作用的BEO相比，该水凝胶体现出对BEO缓慢释放的特性，也因此使水凝胶具有了持续抑菌的优异性能。由图6(c)可以看出，BEO在挥发36 h后，已失去抑菌性，但同一时间下水凝胶仍具有较好的抑菌性，且挥发72 h后还有明显的抑菌圈。同时BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶在模拟体液中的缓释抑菌性也能从图6(d)中得到证实，0.5 h后对E.coli和S.aureus的抑制率分别为97.59%和25.12%，1 h后抑制率均为100%。由此可知，该水凝胶具有良好的缓释抑菌性能。

图6 (a) BEO和BEO@Zein在37℃空气中的挥发率；(b) BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶在磷酸盐缓冲溶液(PBS)中对BEO的释放；(c) BEO (以滤纸为载体)和BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶在37℃空气中挥发36 h和72 h后对E.coli的抑菌性；(d) BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶在模拟体液中释放BEO对E.coli和S.aureus的抑菌性Fig.6 (a) Volatilization ratio of BEO and BEO@Zein in 37℃ air; (b) BEO release of BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel in phosphate buffer saline (PBS);(c) Antibacterial activity of BEO (filter paper as carrier) and BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel on E.coli after volatilization in 37℃ air for 36 h and 72 h;(d) Bacteriostasis of BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel releasing BEO in simulated body fluids on E.coli and S.aureus

水凝胶的持续抑菌性如图7(a)和图7(b)所示，PVP-PVA水凝胶没有抑菌性，负载BEO@Zein后，BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶对E.coli和S.aureus均有良好且持久的抑菌性，抑菌24 h后抑菌圈直径分别为20 mm和28 mm，且持续抑菌72 h后仍有较大的抑菌圈。可见，BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶具有优异的抑菌持久性。

图7 PVP-PVA水凝胶和BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶对E.coli (a)和S.aureus (b)持续抑菌24 h和72 h后的抑菌性；BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶抗E.coli生物膜(c)和S.aureus生物膜(d)性能Fig.7 Antibacterial activity of PVP-PVA hydrogel and BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel against E.coli (a) and S.aureus (b) after 24 h and 72 h of sustained bacteriostasis; BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel against E.coli biofilms (c) and S.aureus biofilms (d)

细菌感染与细菌生物膜的形成密切相关。BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶对细菌生物膜的抑制结果如图7(c)和图7(d)所示，水凝胶显著抑制了E.coli和S.aureus形成的生物膜，对S.aureus生物膜的抑制率可以几近达到100%，表明该水凝胶具有良好的抗生物膜性能。

BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的缓释抑菌机制如图8所示。把水凝胶贴在皮肤伤口处，BEO依次从纳米粒子和水凝胶中缓慢释放到伤口上。BEO中含有抑菌成分丁香酚，它具有破坏微生物细胞膜的能力，可导致细胞壁破裂、细胞膜渗透损伤、成分泄漏和细胞死亡[10]。因此，BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶可以通过缓释BEO抑制伤口发生细菌感染。此外，在上述抑菌实验中该水凝胶对S.aureus的抑菌效果更好，这可能是由于BEO中丁香酚等疏水化合物能与S.aureus等革兰氏阳性菌的细胞膜直接相互作用，而E.coli等革兰氏阴性菌的亲水细胞膜会阻碍疏水化合物的渗透，因此E.coli对BEO的抵抗力更强[24]。

图8 BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的缓释抑菌机制示意图Fig.8 Schematic diagram of slow-release bacteriostatic mechanism of BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel

2.3 BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的力学性能、溶胀保湿性和降解性

作为伤口敷料应该具备一定的力学性能，因此对BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶进行了力学性能的测试。如图9(a)所示，在PVA中引入PVP，PVA水凝胶和8.5wt%PVA水凝胶的拉伸强度分别增大到0.64 MPa和0.28 MPa，断裂伸长率也分别提高至479.20%和425%。其性能改善的原因应是PVP中的羰基(C=O)和PVA中的羟基(O-H)形成了氢键相互作用力[25]。对比PVA水凝胶和8.5wt%PVA水凝胶及PVP-PVA水凝胶和PVP-8.5wt%PVA水凝胶，前者PVA的质量分数高，力学性能也更好。这是由于水凝胶中PVA含量越高，PVA结晶性越好，力学性能越强。然而，在PVPPVA水凝胶中加入BEO@Zein悬浮液，水凝胶中PVA的质量分数降为8.5wt%，因此BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的力学性能有所下降，但其拉伸强度和断裂伸长率仍可达到0.33 MPa (大于PVP-8.5wt%PVA水凝胶)和402.52%。

图9 (a) PVA水凝胶、8.5wt%PVA水凝胶、PVP-PVA水凝胶、PVP-8.5wt%PVA水凝胶、BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的应力-应变曲线；(b) PVA水凝胶、PVP-PVA水凝胶、BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶在PBS溶液中的溶胀率曲线；(c) BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶在37℃和25℃下的失水率曲线；(d) PVP-PVA水凝胶和BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶在土壤和PBS溶液中的降解率曲线Fig.9 (a) Stress-strain curves of PVA hydrogel,8.5wt%PVA hydrogel,PVP-PVA hydrogel,PVP-8.5wt%PVA hydrogel,and BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel;(b) Swelling ratio curves of PVA hydrogel,PVP-PVA hydrogel,and BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel in PBS solution; (c) Water loss ratio curves of BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel at 37℃ and 25℃; (d) Degradation ratio curves of PVP-PVA hydrogel and BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel in soil and PBS solution

伤口敷料应该具有吸收伤口渗出液并维持伤口环境湿润的作用，因此对BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶进行了溶胀测试。如图9(b)所示，PVA水凝胶对PBS溶液的吸收在8 h后基本饱和，溶胀率可以达到229%以上，PVP-PVA水凝胶在同一时间溶胀率达到285%以上，这可能要归因于PVP的高极性基团，使其具有强亲水性。由于BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的多孔结构及Zein的亲水基团，因此其初始溶胀速率相对更快，8 h的溶胀率为332%。同时，BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的失水率曲线如图9(c)所示，在25℃和37℃下，水凝胶8 h内的失水率分别达到了40%和85%以上。在同一时间下BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的溶胀率要远高于失水率。因此，BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶能通过吸收伤口渗出液维持伤口环境湿润，即具有良好的溶胀保湿性。

除此之外，BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶伤口敷料还具有降解性。Zein、PVP和PVA本身都具有良好的降解性[26]。降解率如图9(d)所示，水凝胶在土壤和PBS溶液中的降解率非常接近。PVPPVA水凝胶和BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的降解率在10天后分别为20%和50%，此后，降解速率变慢。在70天后，BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的降解率为60%，是PVP-PVA水凝胶的2倍。BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶整体的降解率明显高于PVPPVA水凝胶，是由于BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的PVA含量低于PVP-PVA水凝胶，水凝胶中PVA含量越低，PVA结晶性越差，水凝胶交联度越小，因此降解性越好。随着时间的不断增加，BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的降解率一直在缓慢增加，如果有充足的时间，水凝胶有可能被完全降解。

2.4 BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶的血液相容性

血液相容性是伤口敷料最重要的性能之一，以防止对人体造成伤害，因此用红细胞溶血实验评价血液相容性。PBS和水处理的红细胞分别作为阴性对照和阳性对照。BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶处理的红细胞的溶血率基本为0 (图10(a))，离心后上清液为浅黄色透明溶液(图10(b))，与阴性对照接近。光学图像显示，与阴性对照(图10(c))相比，红细胞在BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶处理后没有发生明显的形态学转变(图10(d))，说明红细胞基本没有发生溶血现象。因此，BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶具有良好的血液相容性。

图10 水、PBS和BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶处理的红细胞的溶血率(a)和图像(b)；PBS (c)和BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶(d)处理的红细胞的光学图像Fig.10 Hemolysis ratio (a) and pictures (b) of red blood cells treated with water,PBS and BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel; Optical images of red blood cells treated with PBS (c) and BEO@Zein/PVP-PVA hydrogel (d)

3 结 论

(1) 纳米罗勒精油(BEO@Zein)形成了以BEO为核、Zein为壳的纳米结构，其形貌为规则的球形，平均粒径为56.3 nm。BEO@Zein能提高BEO的热稳定性，并降低其挥发性。

(2) 纳米罗勒精油/聚乙烯吡咯烷酮-聚乙烯醇(BEO@Zein/PVP-PVA)水凝胶伤口敷料可以缓慢释放BEO，从而表现出优异的缓释抑菌性能。此外，水凝胶还表现出显著的抗细菌生物膜性能，对S.aureus生物膜的抑制率几近达到100%。

(3) BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶以PVA结晶和氢键交联，具有较好的力学性能(断裂伸长率为402.52%)，同时多孔结构使其具有较强的溶胀保湿性(溶胀率8 h可达332%，远高于同期失水率)，此外还具有良好的降解性。

(4) BEO@Zein/PVP-PVA水凝胶处理过的红细胞的溶血率基本为0，细胞也没有发生形态学转变，具有良好的血液相容性。